2001 年度実績報告書

RecA-オリゴヌクレオチド複合体による転写因子結合部位の選択的DNA損傷

研究課題

研究課題/領域番号	13672230
研究機関	帝京大学
研究代表者	橘高敦史帝京大学, 薬学部, 助教授 (00214833)
研究分担者	吉田彰宏帝京大学, 薬学部, 助手 (10292301) 須原義智帝京大学, 薬学部, 助手 (30297171) 藤島利江帝京大学, 薬学部, 助手 (90286980) 杉山亨東京大学, 大学院・総合文化研究科, 助手 (40242036)
キーワード	RecA蛋白 / 遺伝子組換え酵素 / オリゴヌクレオチド / シッフ塩基 / CDスペクトル / ゲル電気泳動 / 凝集 / ホルミルウリジン
研究概要	大腸菌の遺伝子組換え酵素RecAを利用して、ラジカルを発生可能な修飾塩基を含む任意の塩基配列のオリゴヌクレオチドを標的遺伝子まで輸送し、相補的対合を形成するために、まず、RecAのDNA結合部位に輸送すべきオリゴヌクレオチドを安定に結合させる検討を行った。これにはRecAのDNA結合部位にリジン残基が一つ存在することに着目し、5-ホルミルウリジン(X)含有オリゴヌクレオチドとのシッフ塩基形成が適用できると考えた。リジンとXのモノマー同士を反応させた場合、有機溶媒中ではシッフ塩基を形成するが、水溶液中ではほとんど原料のままであることが知られている。このモノマーレベルでは水中で安定に生成しないシッフ塩基の形成が、オリゴマーレベルでは可能であることを立証した。 RecAのDNA結合部位であるループL2部位に相当する20アミノ酸残基からなるオリゴペプチド(FECO)と、リジンをアルギニンに変えた変異体(K6R)をFmoc法により固相合成した。X含有オリゴヌクレオチドはジオール体として固相合成した後、過ヨウ素酸酸化によりホルミル体に導いた。各合成ペプチドと天然DNA(dT)_<21>及びX含有オリゴヌクレオチドとの結合をCDスペクトルにより調べたところ、ペプチドのコンホメーションがDNAの添加によってランダムコイルからβ-シートに変化し、リジンをアルギニンに変えてもDNA結合活性は保持されることが確かめられた。しかし、その結合様式には大きな違いがあった。すなわち反応生成物の性質について、遠心を利用したaggregation assayにより調べたところ、Xとリジンが共存する場合にのみ生成物の凝集が起こっていることが明らかになった。また、ゲル電気泳動法による解析では、Xとリジンが共存する場合に起こるオリゴマーレベルでの生成物は、泳動中でも安定であることが判明した。要となるシッフ塩基の形成反応は、モノマー同士の場合と異なり、水溶液中でもかなり効率よく進行し、RecA蛋白によるオリゴヌクレオチドの標的遺伝子までの輸送に有効だと考えられる。

研究成果
(6件)

すべてその他

すべて文献書誌 (6件)

[文献書誌] Kittaka, A., Takayama, H., Kurihara, M.et al.: "DNA Sequence Recognition by NFκB p50 Homodimer: Strict and Obscure Recognition Sites in the Binding Sequence"Nucleosides,Nucleotides and Nucleic Acids. 20・(4-7). 669-672 (2001)
[文献書誌] Sugiyama, T., Kittaka, A., Takayama, H.et al.: "Chemical Cross-Linking of Peptides Derived from RecA with Single-Stranded Oligonucleotides Containing 5-Formy1-2'-deoxyuridine"Nucleosides,Nucleotides and Nucleic Acids. 20・(4-7). 1079-1083 (2001)
[文献書誌] Sugiyama, T., Kittaka, A., Takayama, H., Kuroda, R.: "Evidence for a Schiff Base Formation of Peptides Derived from RecA with Single-Stranded Oligonucleotides Containing 5-Formy1-2'-deoxyuridine"Nucleic Acids Research Suppl.. No.1. 175-176 (2001)
[文献書誌] Suhara, Y., Nihei, K., Kurihara, M., Kittaka, A.et al.: "Efficient and Versatile Synthesis of Novel 2α-Substituted 1α,25-Dihydroxyvitamin D_3 Analogues and Their Docking to Vitamin D Receptor"The Journal of Organic Chemistry. 66・26. 8760-8771 (2001)
[文献書誌] 高山浩明, 橘高敦史, 藤島利江, 須原義智: "A環修飾活性型ビタミンD_3の合成と活性"有機合成化学協会誌. 60・4(印刷中). (2002)
[文献書誌] 橘高敦史, 須原義智, 平阪幸四郎, 藤島利江, 吉田彰宏、他: "2α-ベンジル-1α,25-ジヒドロキシビタミンD_3の合成とVDR結合活性"ビタミン. 75・4. 196-197 (2001)

2001 年度 実績報告書

RecA-オリゴヌクレオチド複合体による転写因子結合部位の選択的DNA損傷

研究代表者

橘高 敦史 帝京大学, 薬学部, 助教授 (00214833)

研究成果

[文献書誌] Kittaka, A., Takayama, H., Kurihara, M.et al.: "DNA Sequence Recognition by NFκB p50 Homodimer: Strict and Obscure Recognition Sites in the Binding Sequence"Nucleosides,Nucleotides and Nucleic Acids. 20・(4-7). 669-672 (2001)

[文献書誌] Sugiyama, T., Kittaka, A., Takayama, H.et al.: "Chemical Cross-Linking of Peptides Derived from RecA with Single-Stranded Oligonucleotides Containing 5-Formy1-2'-deoxyuridine"Nucleosides,Nucleotides and Nucleic Acids. 20・(4-7). 1079-1083 (2001)

[文献書誌] Sugiyama, T., Kittaka, A., Takayama, H., Kuroda, R.: "Evidence for a Schiff Base Formation of Peptides Derived from RecA with Single-Stranded Oligonucleotides Containing 5-Formy1-2'-deoxyuridine"Nucleic Acids Research Suppl.. No.1. 175-176 (2001)

[文献書誌] Suhara, Y., Nihei, K., Kurihara, M., Kittaka, A.et al.: "Efficient and Versatile Synthesis of Novel 2α-Substituted 1α,25-Dihydroxyvitamin D_3 Analogues and Their Docking to Vitamin D Receptor"The Journal of Organic Chemistry. 66・26. 8760-8771 (2001)

[文献書誌] 高山浩明, 橘高敦史, 藤島利江, 須原義智: "A環修飾活性型ビタミンD_3の合成と活性"有機合成化学協会誌. 60・4(印刷中). (2002)

[文献書誌] 橘高敦史, 須原義智, 平阪幸四郎, 藤島利江, 吉田彰宏、他: "2α-ベンジル-1α,25-ジヒドロキシビタミンD_3の合成とVDR結合活性"ビタミン. 75・4. 196-197 (2001)

2001 年度実績報告書

橘高敦史帝京大学, 薬学部, 助教授 (00214833)