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1)トランスジェニックマウス作製用トランスジーンの構築
マウスPHBPcDNAのコーディング領域をサイトメガロウイルスエンハンサー、ニワトリβ-アクチンプロモーターを持つpCAGGSベクターにサブクローニングし、挿入されている方向を制限酵素消化により確認しPHBPmRNAが転写される方向に挿入されたものと、逆にPHBPmRNAと二本鎖を形成し、その翻訳を抑制するアンチセンスRNAが転写される方向に挿入されたものの二種類のトランスジーンを調製した。また、上記と同様の操作によりpCALNL5というCre-loxPシステムにより発現をコントロールできるベクターに組み込んだ発現ベクターも作成した。
2)作成したトランスジーンの機能測定
作成したトランスジーンが正常に機能するかを調べるために、トランスジーンをCHO細胞にトランスフェクションし、リコンビナント・マウスPHBPが合成され培地に分泌されているかをウエスタンブロット法により調べたところ、期待通りリコンビナント・マウスPHBPの合成が確認できた。
3)トランスジェニックマウスの作成
現在、マウス受精卵に作製したトランスジーンをマイクロインジェクション法により注入し、それらを仮親マウスの卵管内に移植して出産させる操作を行っているところである。今後は、生まれたマウスの尾からDNAを調整し、PCR及びサザンブロット解析によりトランスジーンが導入されているマウスを選択し、これらのマウスをメーティングする事により完全なトランスジェニックマウス系列を確立し、センス方向に導入されたものと、アンチセンス方向に導入されたものをそれぞれ三系列ずつ作製する予定である。
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