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1。Knock-in、およびKndck-out用プラスミドの作製
(1)BRCA2遺伝子ノックアウト用プラスミド
申請時に記載した遺伝子破壊用ベクターはBRCA2遺伝子のN末部分が発現される可能性があったため、新たにBRCA2遺伝子のプロモーターから最後のExon27までを大きく欠失させる破壊用ベクターを作成した。
(2)コンディショナルノックアウト用プラスミド
BRCA2遺伝子プロモターの上流に2つのloxPシグナルではさまれた選択マーカー(HisまたはBsr)と、第2イントロンに3つ目のloxPシグナルが挿不されるようなコンディショナルノックアウト用ベクターを作成した。
(3)N末端半分のBRCA2を発現するプフスミド
第11Exonに存在する8回のアミノ酸繰り返し配列(BRCリピート)の中で3番目のBRCリピートの後に終止コドンが導入されるようなtargetingベクターを作成した。従ってtargetingを起こしたalleleからは、C末端を欠いたBRCA2蛋白が発現することになる。
2。上記のプラスミドでtargetingしたDT40細胞の作製
(1)BRCA2ヘテロ変異株の作製
野生型のDT40に、1-(1)のプフスミドをトランスフェクションし、一方のallele上のBRCA2遺伝子が欠失した細胞を得ることができた。
(2)(1)で作製したヘテロの細胞に1-(2)のプラスミドをトランスフェクションしてもう一方のalleleがコンディショナルにノックアウトできるような細胞株を得ることができた。
(3)(1)で作製したヘテロの細胞に1-(3)のプラスミドをトランスフェクションして正しくtargetingが起きているクーローンを選択中である。
3。XRCC3遺伝子のコンディショナルノックアウト細胞の作製
BRCA2のC末端が欠損したマウス細胞は、γ線やクロスリンカー等の薬剤に対する感受性がRad51パラログが欠損した細胞と非常によく似た特徴を示すので、BRCA2はRad51パラログと同じエピスタシス群に属することが予想される。これを遺伝学的に証明するために、Rad51パラログの一つであるXRCC3のコンディショナルノックアウト細胞をまず作製した。
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