| 研究概要 |
1 アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼと正常基質との反応を時分割スペクトルのグローバルアナリシスおよび重水素同位体効果の解析を組み合わせることにより,重要な中間体間の速度定数の大部分を決定した。特に従来基質アナログとの反応でしか見られなかった「基質結合に伴う補酵素-Lys258シッフ塩基のpK_a、の上昇」を正常基質について初めて証明した。このpK_aの上昇は基質結合に伴って大小ドメインが接近するとGly38主鎖のカルボニル基がシッフ塩基に接近するために,脱ブロトン化状態にあるシッフ塩基と静電的な反発を起こすためであることをV39F変異によって示した。これを本研究の主題である「三次元エネルギー準位解析」に供したところ,Gly38の動きはミハエリス複合体の不安定化を起こし,それによってたk_<cat>を増大していることが本質的な意義であることが判明した。したがって,従来から言われてきた「基質結合に伴うシッフ塩基のpK_aの上昇」は「ミハエリス複合体の不安定化」の結果として起こった付随的現象であることが示された。
2 アミノ基転移酵素の近縁酵素であるラセマーゼのプロトン移動過程においては触媒に必須の塩基残基間のプロトン移動過程が問題であった。基質アナログと補酵素の複合体の結晶解析に分子軌道計算を組み合わせることにより,基質カルボキシル基がこのプロトン移動を仲介し,さらに,それを可能とするように補酵素のプロトン化状態が調節されていることを示した。
3 ヒスチジノールリン酸アミノ基転移酵素,分枝アミノ酸アミノ基転移酵素について単独および基質(アナログ)複合体の結晶構造を得た。
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