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1.反応中間体形成時のATP結合
プロトンポンプ標品におけるリン酸化反応中間体(EP)の生成量とATPの結合量の測定を定常状態にて検討した。その結果、
(1)[γ-^<32>P]ATPを用いた酸安定なEPの蓄積量はα鎖をドデシル硫酸にて可溶化後、さらにゲルろ過にて分離後、分画したα鎖の280nmの紫外吸収と結合している^<32>Pの量比から算出した。その結果、α鎖1mol当たりEP結合量は0.5molであることが明らかになった。MgCl_2存在下、酵素へのATPの結合は[α-^<32>P]ATPを用いるとα鎖1mol当たり0.5mol検出された。一方、[γ-^<32>P]ATPの場合、1molの結合が検出された。これらの結果から、EPを形成していない触媒サブユニットはH^+-ATPase反応のサイクル中ATPを結合していることが明らかになった。
(2)ATPの結合におけるATP濃度依存性からリン酸化中間体の生成に必要な濃度は1.1μMであるのに対し、リン酸化中間体を生成しないサブユニットへのATPの結合は150μMを必要とした。
2.リン酸化酵素中間体形成とルビジウムイオンの閉塞量
リン酸化反応中間体経由で閉塞されるルビジウムイオンの結合に関して、定常状態における速度論解析を行った。その結果、リン酸化酵素依存的なルビジウムイオンの酵素への閉塞は観察されるが、その量は極めて低く、また完全なリン酸化酵素の分解は観察されない。ルビジウムイオンの化学量論的な結合の測定にはバナジン酸などの不可逆的なリン酸化アナログの結合が必要である。
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