胃プロトンポンプの反応機構解析

2002 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 13680703
• 研究機関: 北海道大学
• 研究代表者: 嘉屋 俊二 北海道大学, 大学院・理学研究科, 助教授 (90186023)
• キーワード: ナトリウムポンプ / 蛍光プローブ / 1分子観察

研究概要

平成14年度の研究実績
1.プロトンポンプの分子観察によるポンプ分子の多量体構造の検討
FITCによってそれぞれのポンプ分子の触媒サブユニットのATP結合部位に存在するリシン残基にほぼ100%化学修飾を施した。修飾ポンプ標品をC12E8にて可溶化後、全反射蛍光顕微鏡にて観察し、消光過程の時間経過をモニターし、解析した。さらにn-octylglucosideによる可溶化を行い、C12E8にて可溶化した標品との比較を行った。
その結果、1.プロトンポンプ標品において、FITC標識した酵素分子の蛍光消光の時間経過から量子的な蛍光消光を確認した。また輝点の初期輝度分布から単量体から4量体の多量体構造が存在することを確認した。
2.C12E8による可溶化によってポンプは酵素活性をほとんど失った。一方、n-octylglucosideによる可溶化画分はほぼ活性を保持していた。可溶化画分の蛍光スポットの初期強度分布による多量体度は両者に大きな違いが見られた。C12E8では単量体と2量体が主要成分であるのに対し、n-octylglucosideでは主に2量体と4量体が観察された。
以上の結果はプロトンポンプにおいて、活性を発現する最小機能単位は少なくとも2ないし4量体であることを示唆している。さらにC12E8にて可溶化した画分においても2量体が存在することから、2量体自体は活性をもたない可能性が高い。すなわちプロトンポンプは膜中では4量体で機能していることが強く示唆された。

研究成果

• [文献書誌] K.Abe: "Gastric H/K-ATPase liberates two moles of Pi from one mole of phosphoenzyme formed from a high-affinity ATP binding site and one mole of enzyme-bound ATP at the low affinity site during cross-talk between catalytic subunits"Biochemstry. 192・41(2). 2438-2445 (2002)
• [文献書誌] S.Teramachi: "Single replacement of several amino acid side chain exposed inside of the ATP binding pocket induces different extent of affinity change in the high and low affinity ATP binding sites of rat Na/K-ATPase"J.Biol.Chem.. 277・40. 37394-37400 (2002)
• [文献書誌] N.Fujitani: "Structure determination and Conformational change induced by tyrosine phosphorylation of the N-terminal domain of the α-chain of pig gastric H^+/K^+-ATPase"Biochem.Biopys.Res.Commun.. 3・300(1). 223-229 (2003)
• [文献書誌] K.Abe: "K^+ induced simultaneous liberation of two moles of Pi, one from one mole of EP and the other from EATP, of oligomeric H/K-ATPase from pig stomach"Ann.N.Y.Acad.Sci.. 986(印刷中). (2003)
• [文献書誌] S.Kaya: "Oligomeric structure of P-type ATPases observed by single molecule detection technique"Ann.N.Y.Acad.Sci.. 986(印刷中). (2003)