古細菌由来アミノアシル-tRNA合成酵素の構造とtRNA認識機構の解明

2002 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 13680705
• 研究機関: 山形大学
• 研究代表者: 長谷川 典巳 山形大学, 理学部, 教授 (60095023)
• 研究分担者: 久野 敦 山形大学, 理学部, 助手 (50302287)
• キーワード: tRNAアイデンティティー / 古細菌 / Aeropyrum pernix / チロシル-tRNA合成酵素 / チロシンtRNA / in vitro転写反応

研究概要

超好熱性古細菌Aeropyrum pernix K1のゲノムライブラリーからチロシル-tRNA合成酵素(TyrRS)のクローニングと発現を行った。初めは発現量が極めて少なかったが、A.pernixゲノムは大腸菌のレアコドンを頻用しており、それらのコドンに対応するtRNAを共発現させるごとで、TyrRSの大量発現に成功した。TyrRSの酵素化学的諸性質につい下調べたところ、最も注目すべき特徴は、熱に対する安定性であり、90℃に30分間酵素溶液を処理しても、酵素活性の低下はほとんど見られなかった。従って、90℃の熱処理という簡便な操作によりTyrRSの粗精製を行った。純度の高い野生型TyrRSを得るために、TyrRSが二量体を形成する性質を利用してHis-tag融合TyrRSの固定化カラムによる新規なアフィニティ-精製法を開発し、野生型酵素の簡易精製法の確立にも成功した。T7 RNAポリメラーゼを用いたin vitro反応でtRNA変異体を作製し、精製したTyrRSを用いたチロシル化反応を行い、各転写物に対する径時的反応を測定することにより、A.pernixのチロシンtRNAアイデンティティーの解明を行った。A.pernixチロシンtRNAのC1-G72塩基対に着目し、同じC1-G72塩基対を有し、なおかつこの塩基対が認識部位となっている大腸菌プロリンtRNAに対してチロシル化反応を行ったところ、驚くべきことにアンチコドンが全く異なるにも関わらず、チロシル化活性を検出した。この現象はin vitro転写物だけでなく、大腸菌のNativeプロリンtRNAでも同じであった。そこで、A.pernixのチロシンtRNAについてA73およびC1-G72塩基対の詳細な変異体tRNAを作製してその活性を調べたところ、アクセプターステムにおいては、生物界共通に存在する識別位塩基A73と古細菌および真核生物に共通な構造であるC1-G72塩基対が、A.pernixの系でも強い認識部位となっており、特にG72が強く認識されていることを新たに発見した。この認識部位は大腸菌のプロリンtRNAの認識部位と酷似しており、異なるアミノ酸種tRNAの認識部位が生物種によって重なっているというたいへん興味深い結果となった。また、他のアミノ酸種tRNAにC1-G72塩基対を導入するだけで、チロシル化活性を検出することから、このC1-G72塩基対は認識だけではなく、他のアミノ酸種tRNAを識別するのに重要な部位であることを明らかにした。これらの結果は、古細菌tRNAとアミノアシル-tRNA合成酵素の分子進化を考える上でたいへん興味深い。

研究成果

• [文献書誌] Nagaoka, Y., Hasegawa, T., et al.: "Molecular recognition of threonine tRNA by threomyl-tRNA synthetase from an extreme thermohilic archoen, Aeropyrum ptmix K1"Nucl. Acids Res. Suppl.. 2. 81-82 (2002)
• [文献書誌] Taki, M., Hasegawa, T., et al.: "A novel fluorescent nonnatural amino acid that can be incorporated into a specific position of streptavidin"Nucl. Acids Res. Suppl.. 2. 203-204 (2002)
• [文献書誌] Iwaki, J., Hasegawa, T., et al.: "Differences in tyrosine tRNA identity between Escherichia coli and archaeon, Aeropyrm permix K1"Nucl. Acids Res. Suppl.. 2. 225-226 (2002)
• [文献書誌] Kikuchi, K., Hasegawa, T., et al.: "In vitro selection of RNA aptamers that bind to domain II of HCV IRES"Nucl. Acids Res. Suppl.. 2. 267-268 (2002)
• [文献書誌] Nagaoka, Y., Hasegawa, T., et al.: "Evolution and tRNA recognition of threonyl-tRNA synthetase from an extreme thermophilie archeaeon, Aeropyram pernix K1"Viva Origino. 31・1. 62-70 (2003)
• [文献書誌] Kikuchi, K., Hasegawa, T., et al.: "RNA aptamers fargeted domain II of hepatitis C IRES could bint its apical loop region"J. Biochem.. 133(in press). (2003)