古細菌由来アミノアシル-tRNA合成酵素の構造とtRNA認識機構の解明

2003 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 13680705
• 研究機関: 山形大学
• 研究代表者: 長谷川 典巳 山形大学, 理学部, 教授 (60095023)
• キーワード: tRNAアイデンティティー / 古細菌 / Aeropyrum pernix / トリプトファニル-tRNA合成酵素 / トリプトファンRNA / 分子進化

研究概要

超好熱性古細菌Aeropyrum pernix K1のゲノムライブラリーからトリプトファニル-tRNA合成酵素(TrpRS)のクローニングと発現を行った。大腸菌のレアコドンに対応するtRNAをCodonPlusと共発現させることで、大量発現に成功した。本酵素は熱に対する安定性が高く、90℃に30分間処理しても、酵素活性は安定であり、90℃の熱処理とNi-キレートカラムによるアフィニティー操作により酵素の精製を行った。ゲノム配列より報告されているtRNATrpの配列から2次構造を推定すると、通常7塩基からなるアンチコドンループが8塩基となり異常な形体を示す。そのためtRNATrpゲノム配列のイントロン領域がデータベースに報告されているものよりも1塩基長い可能性を考え、報告に基づいたtRNATrp(G31a)とG31aの塩基を欠失させたtRNATrp(ΔG31a)を作製して、それぞれのトリプトファン受容能を比較した。その結果、ΔG31aが圧倒的に高いトリプトファン受容能を示し、ΔG31aが野生型tRNATrpの配列である可能性が高いと考えられた。認識部位を解明するにあたって、TrpRSを用いて、真正細菌である大腸菌及び真核生物である酵母の粗tRNA画分について異種生物間トリプトファニル化活性を測定したところ、共にトリプトファニル化がほとんど検出されなかった。これらの結果はA.pernixのTrpRSがアンチコドン以外にも強い認識部位をもつことを示唆するものである。従って、大腸菌では認識に関わっているとされるアクセプターステムに種々の変異を導入し、野生型tRNATrpのトリプトファニル化活性を比較したところ、識別位塩基、アクセプターステム末端の1番目と2番目の塩基対が強く認識されている結果が得られた。用いた変異体tRNATrpのうち、通常のG1塩基の5'モノリン酸をトリリン酸化にするだけでトリプトファン受容能が著しく低下するという、今まで報告されていないユニークな現象も観察された。アンチコドンの認識についても同様に、アンチコドンに変異を導入したtRNATrpと野生型tRNATrpのトリプトファニル化活性を比較した結果、C34、C35の認識は厳密であるが、A36の認識については弱いことを明らかにした。これらの結果は、大腸菌の系とは大きく異なり、古細菌tRNAとアミノアシル-tRNA合成酵素の分子進化を考える上でたいへん興味深い。

研究成果

• [文献書誌] Nagaoka, Y., Ishikura, K., Kuno, A., Hasegawa, T.: "Evolution and tRNA recognition of threonyl-tRNA synthetase from an extreme thermophilic archaeon, Aeropyrum pernix K1"Viva Origino. 31・1. 62-70 (2003)
• [文献書誌] Kikuchi, K., Umehara, T., Fukuda, K., Hwang, J., Kuno, A., Hasegawa, T.: "RNA aptamers targeted domain II of hepatitis C IRES could bind its apical loop region"Journal of Biochemistry. 133・3. 263-270 (2003)
• [文献書誌] Kuno, A., Taki, M., Kaneko, S., Taira, K., Hasegawa, T.: "Leucyl/Phenylalanyl(L/F)-tRNA-protein transferase-mediated N-terminal specific labeling to a protein in vitro"Nucleic Acids Research Supplement. 3. 259-260 (2003)
• [文献書誌] Yokozawa, J., Okamoto, K., Kuno, A., Hasegawa, T.: "Molecular recognition of proline tRNA by prolyl-tRNA synthetase from hyperthermophilic archaeon, Aeropyrum pernix K1"Nucleic Acids Research Supplement. 3. 247-248 (2003)
• [文献書誌] Hemmi, H., Kuno, A., Ito, S., Kaneko, S., Hasegawa, T.: "1H, 13C 15N chemical shift assignment of xylan-binding domain from Streptomyces olivaceoviridis E-86 β-xylanase"Journal of Biomolecular NMR. 27・1. 91-92 (2003)
• [文献書誌] Ikeda, Y., Kawahara, S., Taki, M., Kuno, A., Hasegawa, T., Taira, K.: "Synthesis of novel histidine analogue and its efficient incorporation into a protein in vivo"Protein Engineering. 16・9. 699-706 (2003)