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1)まず、メタノール培地で培養した酵母H. polymorpha(野生株)のペルオキシソームを含む膜画分からPex14pまたはPex13pを含む膜透過装置複合体の分離精製を試みたが、両peroxinの発現レベルが低く成功しなかった。そこで、N-またはC-末端にHis-tagを付加したPex14pを過剰発現するΔpex14欠失変異株、および、同様にHis-tagを付加したPex13pを過剰発現するΔpex13欠失変異株を作製した。これら発現株より得られたペルオキシソーム膜画分を0.2%または0.5%Nonidet P-40で可溶化した後、Niカラムを用いて精製を行った。なお、両者では可溶化に必要な界面活性剤の濃度が異なることがわかった。また、N-末端にHis-tagを付加したPex14pまたはPex13pを用いた場合、SDS-PAGEでこれらのバンドが確認できる位まで部分精製できることがわかった。また、Pex14pを含む複合体とPex13pを含む複合体が異なることを示唆する結果が得られた。今後は、得られた標品のさらなる精製および部分精製標品に含まれる他のタンパク質成分の同定を行う予定である。
2)In vitroでのimport assay系の確立のために、まず、PCR法にてH. polymorphaのアルコールオキシダーゼおよびアミンオキシダーゼ(AMO)遺伝子を単離した。さらに、転写用ベクター(pCITE-2)にサブクローニングし、in vitro転写系でこれらのmRNAを合成することができた。一方、in vivoのimport assay系については、C末端にPTS1(-SKL)、または、N末端にAMOのPTS2(N末端50残基)を付加したGFP融合遺伝子を作製した。これらのレポータータンパク質を野生株に発現させたところ、生菌のままでの蛍光顕微鏡観察により両融合タンパク質がペルオキシソームに局在していることが示唆された。
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