2002 年度実績報告書

チャネル分子立体構造-機能相関研究のための大腸菌機能発現プラットフォームの開発

研究課題

研究課題/領域番号	13680737
研究機関	福井医科大学
研究代表者	老木成稔福井医科大学, 医学部, 教授 (10185176)
研究分担者	矢部勇東京大学, 分子細胞生物学研究所, 助手 (90111575) 清水啓史福井医科大学, 医学部, 助手 (50324158) 今野卓福井医科大学, 医学部, 助教授 (50225637) 山田克幸福井医科大学, 医学部, 助手 (20313744)
キーワード	大腸菌パッチクランプ / KcsAチャネル / 脂質平面膜法 / 単一チャネル電流 / 大腸菌巨大化
研究概要	チャネル分子の構造機能相関研究は、Kチャネルの立体構造決定を機に、従来の配列-機能解析が立体構造-機能解析に転換した。この流れをさらに進めるには、大量発現によって結晶化を視野に入れることのできる、原核生物由来のチャネル分子を対象として研究を進める必要がある。チャネル分子の大量発現から機能解析までを共通のプラットフォームである大腸菌で行うことが最も効率的であると考えられる。そのさい問題となるのは大腸菌では効率的な機能解析法が確立していないということであり、本研究では大腸菌で直接パッチクランプ法を使える系の確立を目指した。大腸菌の巨大化について再現性よく実験することができたが、パッチ法に関しては多大な技術的な困難が横たわっていた。これらの問題点は完全には解決されておらず、全細胞記録の成功率は極めて低いというのが現状である。KcsAチャネルを発現させた大腸菌で巨大化は問題なく起こり、電気生理学的実験を行った。観察された電流は単なる膜のリークではないチャネル由来の電流が得られた。ところがこの電流はカリウム選択性でないことから、KcsAではなく内在性チャネル由来と考えられた。一方、同じ大腸菌からKcsAを抽出・精製・再構成し、脂質平面膜法で記録すると単一チャネル電流を観察することができ、KcsAの発現量は十分であると考えられる。脂質平面膜法の中でも精度の高いtip-dip法で単一チャネル電流を記録し、詳細なキネティクス解析を行った。さらに、大腸菌パッチにおいてギガシールしたパッチ膜を切り取った、いわゆるinside-out patchではKcsA電流を記録することができた。つまり単一チャネルレベルではinside-outの大腸菌パッチと脂質平面膜法で記録できたが、全細胞記録となると全くKcsA由来の電流を測定できなかったことになる。この二つの現象の乖離を説明するための実験を現在も続けている。一方、大量発現によるKcsAチャネル結晶化の条件などを探ることができた。

研究成果
(7件)

すべてその他

すべて文献書誌 (7件)

[文献書誌] W.Uozumi, K.Yamada, S.Goshima, T.Ona, S.Oiki: "Sodium blocking induced by a point mutation at the C-terminal end of the pore helix of KAT1"J.Membrane Biol.. 181. 163-170 (2001)
[文献書誌] Horie T, Yoshida K, Nakayama H, Yamada.K, Oiki S, Schroender.J.I, Uozumi N: "Two types of HKT transporters with different properties of Na+ and K+ transport in Oryza sativa"Plant Journal. 27. 129-138 (2001)
[文献書誌] Maeser P, Hosoo K, Nakayama H, Oiki S, Schroeder J I, Uozurni N: "Glycine residues in potassium channel-like selectivity filters determine Potassium selectivity in four-loop-per-subunit HKT"Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 99. 6428-6433 (2002)
[文献書誌] Kamatari.Y., Dobson, C.M., Konno, T.: "Structural dissection of alkaline-denatured pepsin"Protein Sci.. 12. 717-724 (2003)
[文献書誌] Shimizu, H., Toyoshima, C., Oiki.S: "Interaction between Tetraethylammonium and Permeant Cations at the Inactivation Gate of the HERG Potassium Channel"Jpn.J.Physiol.. 53. 25-34 (2003)
[文献書誌] Futaki, S., Zhang, Y., Kiwada, T., Yagami, T., Oiki, S., Sugiura, Y.: "Gramicidin-based Channel Systems for the Detection of Protein-ligand Interaction"Bioorg.Med.Chem.. (In press). (2003)
[文献書誌] 老木成稔: "生物物理ハンドブック"石渡信一, 桂勲, 桐野豊, 美宅成樹編広川書店(印刷中).

2002 年度 実績報告書

チャネル分子立体構造-機能相関研究のための大腸菌機能発現プラットフォームの開発

研究代表者

老木 成稔 福井医科大学, 医学部, 教授 (10185176)

研究成果

[文献書誌] W.Uozumi, K.Yamada, S.Goshima, T.Ona, S.Oiki: "Sodium blocking induced by a point mutation at the C-terminal end of the pore helix of KAT1"J.Membrane Biol.. 181. 163-170 (2001)

[文献書誌] Horie T, Yoshida K, Nakayama H, Yamada.K, Oiki S, Schroender.J.I, Uozumi N: "Two types of HKT transporters with different properties of Na+ and K+ transport in Oryza sativa"Plant Journal. 27. 129-138 (2001)

[文献書誌] Maeser P, Hosoo K, Nakayama H, Oiki S, Schroeder J I, Uozurni N: "Glycine residues in potassium channel-like selectivity filters determine Potassium selectivity in four-loop-per-subunit HKT"Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 99. 6428-6433 (2002)

[文献書誌] Kamatari.Y., Dobson, C.M., Konno, T.: "Structural dissection of alkaline-denatured pepsin"Protein Sci.. 12. 717-724 (2003)

[文献書誌] Shimizu, H., Toyoshima, C., Oiki.S: "Interaction between Tetraethylammonium and Permeant Cations at the Inactivation Gate of the HERG Potassium Channel"Jpn.J.Physiol.. 53. 25-34 (2003)

[文献書誌] Futaki, S., Zhang, Y., Kiwada, T., Yagami, T., Oiki, S., Sugiura, Y.: "Gramicidin-based Channel Systems for the Detection of Protein-ligand Interaction"Bioorg.Med.Chem.. (In press). (2003)

[文献書誌] 老木 成稔: "生物物理ハンドブック"石渡 信一, 桂 勲, 桐野 豊, 美宅 成樹 編 広川書店(印刷中).

2002 年度実績報告書

老木成稔福井医科大学, 医学部, 教授 (10185176)

[文献書誌] 老木成稔: "生物物理ハンドブック"石渡信一, 桂勲, 桐野豊, 美宅成樹編広川書店(印刷中).