| 研究課題/領域番号 |
13680753
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| 研究機関 | 独立行政法人理化学研究所 |
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研究代表者 |
十川 久美子 理化学研究所, 免疫制御モジュール研究チーム, 研究員 (20291073)
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| 研究分担者 |
嶋本 伸雄 国立遺伝学研究所, 構造遺伝学研究センター, 教授 (20127658)
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| キーワード | DNA結合蛋白質 / 非特異的複合体 / スライディング / RNAポリメラーゼ / 光ピンセット / 1分子操作 / 蛍光観察 |
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| 研究概要 |
昨年度構築したDNAの回転を検出する1分子実験系を用いて、RNAポリメラーゼがスライディングする過程における.Groove-trackingを検証する実験を行った。実験系の概要は以下の通りである。RNAポリメラーゼをDNA結合活性を維持してガラスに固定した。ビーズに一端を固定したDNAの自由端を結合し、ビーズをDNAでtetherした、ビーズをガラスから一定の高さに光ピンセットで保持し、ガラスを一定速度で動かすことで、ガラス上のRNAポリメラーゼに対して、DNAをなぞった。その際のビーズの動きを微小蛍光マーキングにより観察、記録した。蛍光マーキングの動きを解析し、回転運動を検出するための2つの指標を定義し、算出した。一つは、蛍光マーキングの分布から得られるdelta-Rで、ビーズの動きに回転軸があることを示す指標である。もう一つの指標は、蛍光マーキングの位置の時間変化を調べることにより得たRotational Indexで、同方向の回転運動の程度を示す。本実験の他に、コントロール実験として、(1)DNAがない場合、(2)RNAポリメラーゼとDNAの相互作用を妨げるcompetitorを入れた場合、(3)ガラスを停止した場合、について実験を行い、2つの指標を比較した。その結果、competitor存在下ではビーズの回転が抑えられ、ランダムな動きが増加することから、RNAポリメラーゼとDNAの相互作用による回転を検出していることが確認できた。また、本実験は、ガラスを停止させた場合に比べて、回転運動が多くなった。この差は、ガラスを動かして、RNAポリメラーゼとDNAの相対的動きを加えることにより生じたと考えられ、Groove-trackingによる回転を検出していると示唆される。
以上の結果から、Groove-trackingの検証を行うことができた。
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