| 研究概要 |
1,7種類のヒト大腸癌由来培養細胞株におけるp110γタンパク質の発現レベルを解析したところ,すべての細胞株でその発現が極めて低下している(検出限界以下)ことが明らかになった。一方,p110γ遺伝子領域(ヒト7q22)のFISH解析を行ったが,いずれの細胞株においても大きな欠失は見出されなかった。また,RT-PCR解析によってはいずれの細胞株でも,タンパク質の発現が検出されるT細胞株と同等レベルのp110γmRNAの発現が確認された。
2,HCT116,DLD-1細胞株での強制発現実験系において,野生型p110γの外来的な発現はフォーカス形成能低下,軟寒天培地内でのコロニー形成低下,ヌードマウス皮下での腫瘍形成能の低下を引き起こした。また,点変異導入によるPI3K活性不活型p110γの発現は,野生型p110γ発現と同等の作用を示した。
3,p110γは他のタンパク質にも見いだされる3つの機能ドメイン(Ras結合ドメイン,C2ドメインおよびキナーゼドメイン)を有する。これらと,結晶構造解析により見いだされた特徴的なヘリカルドメインおよびN末端領域の,計5種類のp110γ部分断片の発現ベクターを構築し,これらの導入細胞にて,フォーカス形成能,コロニー形成能の評価を試みた。N末端領域,C2ドメイン,ヘリカルドメイン,キナーゼドメインに関しては,安定な発現に成功しておらず,包括的な結論は導けないものの,p110γのRas結合ドメインのみの発現も全長p110γと同程度の,フォーカス形成能,コロニー形成能の低下が導かれるという予備的な知見を得た。
4,しかしながら,野生型p110γの発現はKi-ras欠損DLD-1細胞のコロニー形成も抑制するという予備的な知見を得た。
5,野生型p110γを安定に発現するクローナルなDLD-1細胞株を得た。HCT116細胞では樹立が困難であった。
|
