| 研究課題/領域番号 |
13680828
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| 研究機関 | 東京女子医科大学 |
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研究代表者 |
佐々木 宏 東京女子医科大学, 医学部, 教授 (10014177)
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| 研究分担者 |
本多 祥子 東京女子医科大学, 医学部, 助手 (40287313)
早川 亨 東京女子医科大学, 医学部, 助手 (60322484)
佐藤 二美 東京女子医科大学, 医学部, 助教授 (60205961)
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| キーワード | アストロサイト / Western blot / GFAP / 培養細胞 / アクアポリン / Kir4.1 / ECL |
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| 研究概要 |
アストロサイトに発現している水チャネル、アクアポリン4(AQP4)ならびにアクアポリン5(AQP5)、アクアポリン9(AQP9)、さらに網膜のミュラー細胞でアクアポリン4と共発現していると報告されている内向き整流カリウムチャネルKir4.1の発現をラット初代培養アストロサイトを用いてwestern blotにより検討した。
ラット脳をトリプリン処理し培養フラスコに播種し3〜4継代した後、SDS、ジチオスレイトールにより細胞を溶解し、SDS-PAGEにより分離後、PVDF膜に転写し、一次抗体(各種抗血清)ならびに二次抗体(HRP標識IgG)を加え、化学発光をX線フィルムにより検出した。
アストロサイトに特異的に発現しているとされている中間径フィラメントの一種であるグリア繊維性酸性蛋白(GFAP)は50KDa付近に単一で強い発現を示した。SWISS-PROTのタンパク質データベースによるとGFAPは49.9KDaであるのでこのバンドはGFAPであると確認した。AQP4は30KDa付近と60KDa付近に2本のバンドを示した。データベースによるとAQP4は翻訳開始点を2つ(M1とM23)を有し、M1から翻訳されると34.5KDa、M23から翻訳されると32.5Kdaである。このため30KDa付近と60KDa付近に2本のバンドはそれぞれ分子量が高いバンドがM1からの翻訳生成物、分子量の低いバンドに相当すると考えられる。AQP5ならびにAQP9は60KDa付近に非常に弱いバンドが見られた。SWISS-PROTではラットAQP5タンパクは265アミノ酸残基で分子量は28.4KDaでありラットAQP9タンパクは295アミノ酸残基で分子量は31.4KDaである。今回検討したwestern blotではAQP5タンパクならびにAQP9タンパクとも単量体の分子量を反映せず、二量体と思われる位置にバンドが出現している。Kir4.1は50KDa付近にバンドが見られた。SWISS-PROTではラットKir4.1の分子量は42.5KDaであり、今回のWestern blotで得られた結果と近似していることからKir4.1を同定したものと考えられる。
今後は細胞分画における発現量の検討をWestern blotにより検討を行う。さらには細胞における局在の確認を免疫組織化学的方法により行う予定である。
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