機能的発現に補助因子を必要とするG蛋白共役型受容体の発現機構の分子レベルでの解明

2002 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 13680846
• 研究機関: 長崎大学
• 研究代表者: 上園 保仁 長崎大学, 大学院・医歯薬学総合研究科, 講師 (20213340)
• 研究分担者: 谷山 絃太郎 長崎大学, 大学院・医歯薬学総合研究科, 教授 (70030898)
• キーワード: GABA-B受容体 / G蛋白共役型受容体 / heterodimerization / Xenopus oocyte / heterologous expression / FRET / Electrophysiology / 共焦点レーザー顕微鏡

研究概要

本研究ではこれら補助因子を必要とする受容体の機能的発現のメカニズムについての解明を、クローン化GABA-B受容体、ならびにAM受容体(CRLR+RAMPs)を発現させた細胞を用いて、(1)発現受容体の細胞内局在を免疫組織学的、ならびに共焦点レーザーを用いて特定し、(2)発現受容体の多量体化・複合体化をFluorescence Resonance Energy Transfer (FRET)を用いてアッセイし、さらには(3)GABA, AM受容体刺激後のシグナル伝達機構を電気生理学的にアッセイし、機能性受容体の発現の分子メカニズムを総合的に解析しようとするものである。
(1)については、細胞膜上に機能的受容体が発現するときにはすでに細胞内で受容体が複合化しているという知見を得た。またある種のHeat shock proteinの活性阻害薬(HSP 90 inhibitor geldanamycin)が細胞膜への受容体の移動、並びにdimerizationを抑制するという知見を得た。(2)については、まだ発現の最適化が完全には行われておらず、さらに検討を要している。(3)については、特にGABAB受容体について、GABAB-1R、GABAB-2Rを用いてアフリカツメガエル卵母細胞に機能的な受容体を発現させ、GABAの結合に必要な受容体サブタイプ、また、シグナルを下流に伝えるのに必要不可欠なサブタイプについて、どちらがその役割に関与しているかどうか検討している。そのためにGABAB受容体とG-proteinとを融合させたFusion proteinを作製し、これらを発現させ詳細に解析を試みている。これまでに、GABAの結合にはGABAB-1Rが重要であり、機能発現にはGABAB-2Rが必要であるという興味深い知見を得ている。これらのことは、「機能的であるためにDimerizationを必要とする受容体」において、1)Dimerizationに影響を与える薬物、2)受容体へのリガンド結合に影響を与える薬物(現在まで専らこの点に注目して薬物の開発が行われてきた)、3)機能活性をもつ部位に影響を与える薬物に分けてそれぞれ薬物開発が可能となるということを示唆している。これまでに得られた知見を通して、Dimerizationを形成する受容体に対しての新薬開発という観点からこの研究をさらに発展させていきたいと考えている。

研究成果

• [文献書誌] Shiraishi, M., Minami, K., Uezono, Y, et al.: "Inhibition by tramadol of muscarinic receptor-induced responses in cultured bovine chromaffin cells and in Xenopus oocytes expressing cloned m1 receptors"Journal of Pharmacol. Exp. Therapeutics.. 299. 255-260 (2001)
• [文献書誌] Uezono Y., Nakamura, E., Ueda, Y., et al.: "Production of cAMP by adrenomedullin in human oligodendroglial KG1C cells : comparison with calcitonin gene-related peptide and amylin"Molecular Brain Reserach. 97. 59-69 (2001)
• [文献書誌] Matsuoka, I., Kimura, J., Uezono, Y.: "Involvement of a rapid and localized adenosine formation by ecto-nucleotidases in adenine nucleotide-induced activation of adenosine A2B receptors expressed in Xenopus oocytes"Molecular Pharmacology. 61. 606-613 (2002)
• [文献書誌] Shiraishi, M., Minami, K., Uezono, Y., et al.: "Inhibitory effects of tramadol on nicotinic acetylcholine receptors in adrenal chromaffin cells and in Xenopus oocytes expressing α7 receptors"British Journal of Pharmacology. 136. 207-216 (2002)
• [文献書誌] Okamoto, T., Uezono, Y., et al.: "Inhibitory effects of ketamine and pentobarbital on substance P receptors expressed in Xenopus oocytes"Anesthesia and Analgesia. (In press). (2003)
• [文献書誌] Yanagita, T., Kobayashi, H., Uezono, Y., et al.: "Destabilization of Nav1.7 sodium channel α subunit mRNA by constitutive phosphorylation of ERK : negative regulation of steady-state level of cell surface functional sodium channels in adrenal chromaffin cells"Molecular Pharmacology. (In press). (2003)