| 研究概要 |
本研究の目的は、タモキシフェン-変異エストロジェンレセプター系を利用して、タモキシフェン投与によりマウス個体内の体細胞において遺伝子の不活化を誘導する、いわゆるインデューシブル・ジーンターゲティング法を確立することである。そのためにCreERT2発現ベクターをPCNA遺伝子座にノックインし、増殖の活発な細胞においてCreの発現を誘導するマウスを作製する。
本年度は、タモキシフェン誘導性Creノックインマウスを作製するために、PCNA遺伝子座にCreERT2をノックインするためのターゲティングベクターの作製を行った。CreERT2cDNAは、Pierre Chambon博士より分与していただいた。PCNA遺伝子のエクソン1を含むXbal-Sal1 2.2kbフラグメントをサブクローニングし、CreERT2cDNAを、PCNAとCreのATG開始コドンが一致するように、PCNAのATG開始コドンを含むエクソン1に導入した。ポジティブ選択マーカーとして、2個のloxP配列を両端に付加したネオマイシン耐性遺伝子を、CreERT2の下流に導入した。また、エクソン1内にIRESを導入した形のターゲティングベクターも作製した。いずれのターゲティングベクターも、5'側7.2kb、3'側1.3kbのPCNA遺伝子相同領域を付加,し、ネガティブ選択マーカーとしてDT-A遺伝子を用いた。作製した2種類のターゲティングベクターは、Notlで切断して直鎖化し、エレクトロポレーション法により、マウスES細胞に導入した。
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