| 研究概要 |
本研究は臓器を自在に創造する再生医用へ応用できるような臓器細胞、特に正常な肝臓・腎臓細胞を大量に培養増殖、機能化することを目的とする。前期の報告では牛由来の肝臓上皮細胞、腎臓糸球体上皮細胞の分離および初代培養の条件を検討し、不死化を目的とする遺伝子pSV3neoとhTERTを細胞に導入した。今回はさらに腎臓糸球体内に損傷しやすいメサンギウム細胞と上皮細胞の分離および初代培養の条件を見い出した。通常のmesh seiving方法ではなく、消化酵素を使わず、より弱い物理力で細胞を単離培養できた。細胞の同定はfactor VIII、Thy-1,ZO-1、synapotodinなど糸球体内皮、メサンギウムおよび上皮細胞のメーカを用いて確認した。
機能評価としては、透過性を持つガーゼコラーゲンゲルを用い、両側に細胞を植付き、細胞の選択透過性および相互作用を測定する。その結果、メサンギウムが細胞外基質であるfibronectinを分泌し、ゲルを通して、上皮細胞の接着を強化させ、さらに極性を形成した。
細胞最適保存法としては、形成した細胞のコロニーを選択し、96穴のプレートに移し、低温(-180℃)で凍結する方法を開発した。その利点は、形成した細胞のコロニーを継代しなくても、長期保存できることと、解凍するときの迅速常温度吸引方法により、細胞の生存率が高く維持できることである。細胞のPD(population doubling)も50〜100まで確認できた。
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