細胞シート工学による培養人工尿細管の開発

2002 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 13680954
• 研究機関: 東京女子医科大学
• 研究代表者: 大和 雅之 東京女子医科大学, 医学部, 講師 (40267117)
• 研究分担者: 清水 達也 東京女子医科大学, 医学部, 助手 (40318100)
• キーワード: ポリ(N-イソプロピルアクリルアミド) / 温度応答性表面 / 細胞シートのマニピュレーション / 腎上皮細胞 / 尿細管 / バイオ人工腎

研究概要

我々は、温度に応じて水との親和性を大きく変化させる温度応答性高分子であるポリ(N-イソプロピルアクリルアミド)を培養皿表面に共有結合的に固定化することにより温度応答性培養皿を開発した。この表面は、37℃では市販の培養皿と同程度の弱い疎水性を示し様々な細胞が接着・伸展するが、温度を32℃以下に下げると高度の親水性を示し、トリプシンなどのタンパク質分解酵素を必要とすることなく細胞を脱着させることができる。コンフレントな細胞層を形成させた後に低温処理すると、全細胞を細胞-細胞間接着により連結した一枚の細胞シートとして脱着を・回収することができる。本研究は新しいハイブリッド型人工尿細管の開発をめざして、温度応答性培養皿を用いて作製した腎尿細管上皮細胞シートを多孔膜上に再接着させ、再吸収能・物質産生能の機能評価をおこなう。本年度に以下の成果を得た。
(1)ヒト尿細管上皮細胞シートの作製:昨年度に用いていたイヌ近位尿細管上皮細胞由来株細胞に代えて、正常ヒト尿細管上皮細胞を温度応答性培養皿上で培養し、細胞シートとして回収する条件を確立した。臨床を考慮すると正常ヒト細胞の利用は必須であるが、株化(無限寿命化していない正常)していない正常ヒト尿細管上皮細胞を用いても、培養条件を工夫することにより、細胞シートとして回収し、平膜型透析デバイスに組み込むことができた。(2)物質輸送能に必要な分子群の発現、局在化:人工尿細管デバイスとしての機能に要求される種々の物質輸送関連分子の発現と局在を確認するために、免疫染色後に、共焦点レーザー走査顕微鏡により細胞シート縦断面像作製した。トリプシンで回収し、透析膜上に播種したコントロール群に比べ、有意に良好な局在が認められた。以上により、腎尿細管上皮細胞シートを利用したハイブリッド型人工尿細管の開発の可能性が示された。

研究成果

• [文献書誌] M.Harimoto, M.Yamato, M.Hirose, C.Takahashi, Y.Isoi, A.Kikuchi, T.Okano: "Novel approach for achieving double-layered cell sheets co-culture : overlaying endothelial cell sheets onto monolayer hepatocytes utilizing temperature-responsive culture dishes"J. Biomed. Mater. Res.. 62(3). 464-470 (2002)
• [文献書誌] M.Yamato, C.Konno, M.Utsumi, A.Kikuchi, T.Okano: "Thermally responsive polymer-grafted surfaces facilitate patterned cell seeding and co-culture"Biomaterials. 23. 561-567 (2002)
• [文献書誌] M.A.Nandkumar, M.Yamato, A.Kushida, C.Konno, M.Hirose, A.Kikuchi, T.Okano: "Two-dimensional cell sheet manipulation of heterotypical co-cultured lung cells utilizing temperature-responsive culture dishes results in long-term maintenance of differentiated epithelial cell function"Biomaterials. 23. 1121-1130 (2002)
• [文献書誌] T.Shimizu, M.Yamato, Y.Isoi, T.Akutsu, T.Setomaru, K.Abe, A.Kikuchi, M.Umezu, T.: "Febrication of pulsatile cardiac tissue grafts using a novel 3-dimensional cell sheet manipulation technique and temperature-responsive cell culture surfaces"Circ. Res.. 90. e40-e48 (2002)
• [文献書誌] T.O.Collier, J.M.Anderson, A.Kikuchi, T.Okano: "Adhesion behavior of monocyte, macrophages and foreign body giant cells on poly (N-isopropylacrylamide) temperature-responsive surfaces"J. Biomed. Mater. Res.. 59. 136-143 (2002)
• [文献書誌] T.Shimizu, M.Yamato, T.Akutsu, T.Shibata, Y.Isoi, A.Kikuchi, M.Umezu: "Electrically communicating three-dimensional cardiac tissue mimic fabricated by layered cultured cardiomyocyte sheets"J. Biomed. Mater. Res.. 60. 110-117 (2002)
• [文献書誌] M.Harimoto, M.Yamato, A.Kikuchi, T.Okano: "Tissue Engineering for Therapeutic Use 6, Y.Ikada, Y.Umakoshi and T.Hotta, Eds."Double layerd co-culture of hepatocytes and endothelial cell sheets by cell sheet engineering. 15 (2002)