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はじめに回転円板型培養器を用いてヒトヨタケ(Coprinus cinereus)によるペルオキシダーゼ生産を行った。得られた粗酵素液を用いてフェノール系内分泌撹乱物質の重合沈殿除去を検討した。
ビスフェノールAの除去条件を検討したところ、除去率の温度依存性、pH依存性はフェノールと同様であり、過酸化水素の添加量については、フェノールの場合の約2倍が必要であった。また、ビスフェノールA除去後の溶液の毒性を発光細菌を用いて測定したところ、除去率が上がるに連れて毒性は低下し、除去率100%では殆ど毒性は検出されなかった。この結果から、ペルオキシダーゼによる重合沈殿反応では可溶性の有害な副生成物は発生していないことが分かった。上記のビスフェノールAに関する除去条件の検討結果については、化学工学会福井大会で発表した。現在、反応後のエストロゲン活性について測定中である。
次に、ヒトヨタケにより生産したペルオキシダーゼの精製度とフェノールとの反応性について検討した。培養液は限外ろ過膜、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィーを用いて精製した。生成途中のペルオキシダーゼを用いてフェノールとの反応を行ったところ、精製度が高くなるに連れて除去率は低下した。精製によって除去された不純物の影響を検討したところ、培養液に窒素源(アミノ酸など)として添加したポリペプトンと酵母エキスなどの高分子量物質が影響していることが分かった。これらの不純物は反応生成物(沈殿)によるペルオキシダーゼの失活を抑制する効果があることが分かった。なお、精製したペルオキシダーゼを用いた場合の酵素必要量は、未精製のペルオキシダーゼ(培養液)を用いた場合に比べて4倍程度であった。
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