光合成細菌由来炭酸固定経路である還元的TCA回路の分子生物学的解析

2002 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 13750735
• 研究機関: 京都大学
• 研究代表者: 福居 俊昭 京都大学, 工学研究科, 助手 (80271542)
• キーワード: 緑色硫黄細菌 / Chlorobium limicola / 還元的TCA回路 / ATP-citrate lyase / citrate synthase

研究概要

還元的TCA回路は有機酸を代謝系の中心とした非Calvin回路型のCO_2固定系の一つであり、TCA回路の逆回転により4分子のCO_2から1分子のオキサロ酢酸を生成する。しかし、本回路におけるそれぞれの酵素的性質や反応機構の解析、遺伝子クローニングはこれまで詳しく行われていない。本研究は湖水より単離した緑色硫黄細菌Chlorobium limicola由来還元的TCAによるCO_2固定を分子レベルで明らかにすることを目的とした。
ATP-citrate lyase(ACL)はATPを用いてクエン酸をオキサロ酢酸とアセチルCoAに開裂する逆クライゼン反応を触媒する興味深い酵素であり、原核生物では還元的TCA回路を有する生物にのみ存在している。我々はC. limicola由来ACL遺伝子のクローニングと異種宿主発現を行い、本酵素が真核生物由来酵素と異なるαβヘテロ構造を有していることを明らかにした。本酵素は逆反応を触媒せず、またADPによる競争阻害や、基質であるクエン酸濃度に応じた負の協同性を示し、回路の回転を制御していることを見出した。また[γ-^<32>P]ATPを用いた反応機構の検討により、本酵素のα-サブユニット中のHis273が自己リン酸化され、ついでリン酸基のクエン酸への転移とCoAとの結合によって生じたシトリル-CoAが開裂してオキサロ酢酸とアセチルCoAが生成することを示した。さらに、ADPは自己リン酸化された酵素と可逆的に反応してATPを再生することにより競争的に酵素反応を阻害することを示した。
一方で、本菌ゲノムにはTCA回路の鍵酵素であるcitrate synthase(CS)の相同遺伝子が存在することを見いだした。CSは還元的TCA回路によるCO_2固定を阻害すると予想されることから、その発現および発現産物について検討した。本遺伝子産物は大腸菌由来CSと45%の相同性を示し、その組換え型酵素は確かにCS活性を示した。さらに本菌において本遺伝子が転写・翻訳されていることを見いだした。酵素的性質について検討したところ、本酵素はAMPおよびADPによって強く活性化されたことから、細胞内のエネルギー状態に応じた還元的TCA回路/TCA回路の方向や速度の調節に機能していることが推測された。
また、CO_2固定酵素の一つであるisocitrate dehydrogenaseの遺伝子クローニングおよび生化学的解析を行った。本酵素は、多くの生物に存在するダイマー型とは異なるモノマー型酵素であり、中性付近では脱炭酸活性と同程度の炭酸固定活性を示すこと、オキサロ酢酸によって競争阻害を受けることを明らかとした。

研究成果

• [文献書誌] T.Kanao, T.Fukui, H.Atomi, T.Imanaka: "ATP-citrate lyase from the green sulfur bacterium Chlorobium limicola is a heteromeric enzyme composed of two distinct gene products"Eur. J. Biochemistry. 268. 1670-1678 (2001)
• [文献書誌] T.Kanao, M.Kawamura, T.Fukui, H.Atomi, T.Imanaka: "Charcterization of isocitrate dehydrogenase from the green sulfur bacterium Chlorobium limicola : a carbon dioxide-fixing enzyme in the reductive tricarboxylic acid cycle"Eur. J. Biochemistry. 269. 1926-1931 (2002)
• [文献書誌] T.Kanao, T.Fukui, H.Atomi, T.Imanaka: "Kinetic and biochemical analyses on the reaction mechanism of a bacterial ATP-citrate lyase"Eur. J. Biochemistry. 269. 3409-3416 (2002)