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Aeromonas sobriaのセリンプロテアーゼは菌体外へ分泌される外毒素である。本プロテアーゼが毒素として機能するためには活性を有する成熟体として産生されなければならず、本菌の病原性を理解する上で、セリンプロテアーゼの成熟化の過程を理解することは重要である。申請者らは、セリンプロテアーゼが成熟化の過程で、プロテアーゼ遺伝子の下流に存在するORFにコードされるタンパク(ORF2)の作用を受けることを見いだした。さらなる検討から、ORF2はペリプラスムで機能するタンパクであること、及びORF2は未成熟なセリンプロテアーゼを成熟体へと変換する非常にめずらしいタイプのシャペロンタンパクであることが明らかとなった。しかしながら、このシャペロンタンパクがいかなる作用機序でその機能を発揮するのかはまだ不明であり、さらにシャペロン作用を測定するためのアッセイ系も確立されていない。そこで本年度はシャペロン作用を解析するためにin vitro transcription-translationを利用したアッセイ系を確立し、さらにこれを利用してORF2タンパクのC末端領域の機能の解析を試みた。得られた成果を以下に示す。
1)in vitro transcription-translationの系でセリンプロテアーゼ及びORF2タンパクの合成に成功し、さらにセリンプロテアーゼの活性構造構築に成功した。このアッセイ系を利用することでORF2タンパクのシャペロン作用を直接的に評価することが可能となった。
2)変異ORF2産生株の解析から、ORF2のシャペロン作用発揮にはORF2タンパクのC末端領域、特にC末端のアミノ酸のリジンがシャペロン作用発揮に重要な役割を演じていることが明らかとなった。このC末端領域のシャペロン作用への関与の分子機構を明らかにするために、現在1)で確立した系を用いて解析中である。
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