2001 年度実績報告書

フォンビルブランド因子特異的切断酵素の精製と構造解析

研究課題

研究課題/領域番号	13770583
研究種目	奨励研究(A)
研究機関	奈良県立医科大学
研究代表者	松本雅則奈良県立医科大学, 輸血部, 助手 (60316081)
キーワード	フォンビルデランド因子 / VWF-CPase
研究概要	本年度vWF特異的切断酵素の精製についてFujikawaやGerritsenらによって相次いで報告された。前者は、従来のクロマトグラフィーを用いて、後者は同種抗体を用いて精製に成功している。どちらの精製過程も煩雑であるので、私はモノクローナル抗体を用いて、ワンステップで精製できる方法の確立を目的とした。よって、次年度より私の研究課題名は「フォンビルブランド因子特異的切断酵素のモノクローナル抗体を用いた精製と構造機能解析」と変更予定である。本年度、私はFujikawaらの方法を参考に本酵素を精製し、モノクローナル抗体を作成中である。まず、vWF特異的切断酵素の精製法は、出発材料としてクリオプレチピテートから行い、TBSにて溶解し、終濃度10mMの塩化カルシウムを加えて凝固させ、それを破砕して上清を回収した(フィブリン除去)。その上清に40%硫酸アンモニウム(AS)を加えて遠心し沈殿させ、再度TBSで溶解後、1mM DFP、5mMヨードアセトアミド(IAA)を加え、0.6M ASバヅファーで透析した。透析後sampleをbutyl sepharose(BS)カラムに添加し、0.6Mから0M ASのグラジュエント法にて溶出した。その活性分画を40%ASで沈殿させ、濃縮後、1mM PMSF、5mM IAAを加え、superdex 200カラムに添加し、分離した。その活性分画をHitrap-Heparinに添加し、NaClを0から1.0Mのグラジュェントにて溶出した。その活性分画を再度superdex 200カラムに添加し分離した。この活性分画を濃縮してマウスの免疫に用いた。マウスヘの免疫は、上記で得られた精製vWF-CPaseを現在までに5匹のマウスに計3回の免疫を行った。1回目はcomplete adjuvantと混合し、1匹当たり57μgを免役した。2回目、3回目はincomplete adjuvantと混合し、1匹当たりそれぞれ30μg、53μg免疫を行った。

研究成果
(6件)

すべてその他

すべて文献書誌 (6件)

[文献書誌] Ito M, et al.: "Complete amino acid sequence of kaouthiagin, a novel cobra venom metalloprotease with two disintegrin-like sequences"Biochemistry USA. 40. 4503-4511 (2001)
[文献書誌] Kinoshita S, et al.: "Upshaw-Schulman syndrome revisited : A concept of congenital thrombotic thrombocytopenic purpura"International Journal of Hematology. 74. 101-108 (2001)
[文献書誌] Yagi H, et al.: "Plasma of patients with Upshaw-Schulman syndrome, a congenital deficiency of von Willebrand factor-cleaving protease, enhances the aggregation of normal platelets under high shear stress"British Journal of Haematology. 115. 991-997 (2001)
[文献書誌] Fujimura Y, et al.: "von Willebrand factor-cleaving protease and Upshaw-Schulman syndrome. In : Progress in Hematology"International Journal of Hematology. 75. 25-34 (2002)
[文献書誌] Park Y-D, et al.: "Impaired activity of plasma von Willebrand factor-cleaving protease may predict the occurrence of hepatic veno-occlusive disease after stem cell transplantation"Bone Marrow Transplantation. (In press). (2002)
[文献書誌] 藤村吉博他: "血小板血栓形成の分子機構"アイプリコム出版社. 407 (2002)

2001 年度 実績報告書

フォンビルブランド因子特異的切断酵素の精製と構造解析

研究代表者

松本 雅則 奈良県立医科大学, 輸血部, 助手 (60316081)

研究成果

[文献書誌] Ito M, et al.: "Complete amino acid sequence of kaouthiagin, a novel cobra venom metalloprotease with two disintegrin-like sequences"Biochemistry USA. 40. 4503-4511 (2001)

[文献書誌] Kinoshita S, et al.: "Upshaw-Schulman syndrome revisited : A concept of congenital thrombotic thrombocytopenic purpura"International Journal of Hematology. 74. 101-108 (2001)

[文献書誌] Yagi H, et al.: "Plasma of patients with Upshaw-Schulman syndrome, a congenital deficiency of von Willebrand factor-cleaving protease, enhances the aggregation of normal platelets under high shear stress"British Journal of Haematology. 115. 991-997 (2001)

[文献書誌] Fujimura Y, et al.: "von Willebrand factor-cleaving protease and Upshaw-Schulman syndrome. In : Progress in Hematology"International Journal of Hematology. 75. 25-34 (2002)

[文献書誌] Park Y-D, et al.: "Impaired activity of plasma von Willebrand factor-cleaving protease may predict the occurrence of hepatic veno-occlusive disease after stem cell transplantation"Bone Marrow Transplantation. (In press). (2002)

[文献書誌] 藤村吉博 他: "血小板血栓形成の分子機構"アイプリコム出版社. 407 (2002)

2001 年度実績報告書

松本雅則奈良県立医科大学, 輸血部, 助手 (60316081)

[文献書誌] 藤村吉博他: "血小板血栓形成の分子機構"アイプリコム出版社. 407 (2002)