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ユビキチン結合酵素を標的とした癌抑制蛋白質の分解阻害による抗癌作用の解析の研究を行い、本年度は以下の成果を認めた。
1)培養癌細胞の選定と癌抑制蛋白質の検出
実験に用いる培養細胞は、正常なp53またはp27を有し、分解亢進によって各蛋白レベルが低下していることが必要とされる。その条件を満たす細胞株としてp53についてはHBE4-E6/E7(HPV-16由来E6/E7遺伝子で不死化した肺気管支上皮細胞)を選定し、p27についてはHL60(前骨髄性白血病)、HeLa(子宮頚癌)を選定した。各細胞においてノザンブロットによる遺伝子発現を確認し、またイムノブロットにより蛋白質レベルの発現が抑制されていることを確認した。
2)E2ドミナント変異体遺伝子の調整
P53の分解に関与するとされるE2としてUbcH4、UbcH5を対象とし、p27の分解に関わるE2としてCDC34、UbcH5を対象とした。これらの完全長cDNAを遺伝子バンクより入手でき次第pBluescript vectorに組み込み、部位特異的変異誘発法を用いて各E2のactive Cys残基(ユビキチン運搬活性部位)をコードする塩基をSer残基の塩基に置換する。こうしたE2遺伝子変異体の発現産物は、野生型E2に対してドミナントネガチィブに働くことが知られている。得られた各変異遺伝子を哺乳類細胞での発現が可能なpTRE2 vectorに組み込む予定である。
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