CD28を介する細胞内情報伝達機構におけるLATリン酸化の関与の検討

2001 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 13770881
• 研究種目: 奨励研究(A)
• 研究機関: 山口大学
• 研究代表者: 土田 昌弘 山口大学, 医学部, 助手 (80325216)
• キーワード: Jurkat T cell / 抗CD28 / LAT / チロシンリン酸化

研究概要

急牲ヒトT細胞性白血病細胞(Jurkat T cell ; clone E6-1)を用いて以下の実験をおこなった。
1.抗CD3抗体、抗CD28抗体刺激によるチロシンリン酸化蛋白の検討
Jurkat T cell を1から3μg/mlの濃度の抗CD3抗体(Ancell ; Bayport, MN)、抗CD28抗体(Leu-28,clone L293)により刺激後、蛋白を可溶化、SDS-PAGEにて展開後、PVDF膜に転写、抗ホスホチロシン化抗体にてチロシンリン酸化蛋白を検討したところ、以前より我々が報告してきたように、数種類の蛋白がチロシンリン酸化されているのが確認された。
2.抗CD3抗体、抗CD28抗体刺激によるLATチロシンリン酸化の検討
Jurkat T cellを1から3μg/mlの濃度の抗CD3抗体、抗CD28抗体により刺激後、蛋白を可溶化、抗LAT抗体(Upstate Biotechnology ; Lake Placid, NY)にてLATを疫沈降し、そのチロシンリン酸化を検討したところ、抗CD28抗体刺激後1分でLATのチロシンリン酸化が確認され、10分後でチロシンリン酸化は最大となった。その後15分でチロシンリン酸化は減弱した。
3.抗CD3抗体、抗CD28抗体同時刺激によるLATチロシンリン酸化の検討
Jurkat T cellを1μg/mlの抗CD3抗体と同時に0から3μg/mlの抗CD28抗体にて刺激後、蛋白を可溶化、抗LAT抗体にてLATを免疫沈降し、そのチロシンリン酸化を検討したところ、両抗体刺激により相加的なLATのチロシンリン酸化が確認された。