| 研究概要 |
Jurkat T細胞を抗CD28抗体(Leu-28,clone L293)(Becton Dickinson; San Jose, CA),CD3抗体(Ancell; Bayport, MN)にて刺激後,蛋白を可溶化しSDS-PAGEにより分離、PVDF膜にelectrotransfer後、抗ホスフォチロシン抗体(PY20)(Transduction Laboratorics; Lcxington, KY)にてチロシンリン酸化蛋白を標識、LumiGLO kit (Kirkegaard ＆ Perry Laboratories; Gaithersburg, MD)にて可視化させた。CD28,CD3抗体刺激により速やかに数種類の蛋白がチロシンリン酸化されることが確認できた。
次いでJurkat T細胞をCD28抗体,CD3抗体にて同様に刺激後,抗Pyk2抗体,抗LAT抗体によりPyk2,LATを免疫沈降しPyk2,LATのチロシンリン酸化を検討したところ,CD28抗体刺激により速やかにPyk2,LATのチロシンリン酸化を認めた。
Syk/Zap70 inihibitorであるpiceatannol、PI3-kinase inhibiotrであるwortmanninにより前処理したJurkat T細胞を抗CD3抗体、または抗CD28抗体により刺激後、同様にPyk2,LATのチロシンリン酸化を検討したところ,Zap70 inhibitorによりCD28抗体刺激後のPyk2のチロシンリン酸化は減少したが,PI3-kinase inhibitorによっては減少しなかった
PMA処理によりJurkat T cellよりPKCが枯渇されることが知られているが、同処理によりJurkat T細胞を処理後、同様にPyk2,LATのチロシンリン酸化を検討したところ,Pyk2,LATのチロシンリン酸化には影響を与えなかった。
以上の結果より我々が以前報告したようにPyk2のチロシンリン酸化がCD28を介するT細胞副刺激伝達経路に関与していることが再確認できた。また新たにLATがCD28を介するT細胞副刺激伝達経路に関与していることが示唆された。
|
