| 研究概要 |
1.CRH receptor mRNAの測定
GT1-7細胞中のCRH受容体mRNAの遺伝子発現をRT-PCR(reverce transcription porimerase-chain reaction)を用いて調べた。CRH receptor 1に特異的なprimerを用いてRT-PCRを行い、予想された塩基数のPCR産物を得た。さらに、このPCR産物の塩基配列を確認した。
2.潅流実験
GT1-7細胞2×10^6個をcytodex beadsで2日間培養後、カラムに重層し、DMEMを潅流液とし、0.13ml/minの速度で潅流する。GnRH分泌が、定常状態になった後、潅流液にCRH(10^<-6>,10^<-8>,10^<-10>M)を添加し、カラム潅流液の6分毎の分画中のGnRH濃度をRIAで測定した。潅流液に、CRHを添加すると、潅流液中のGnRH濃度が上昇し、これは有意差をもってCRH濃度依存性に観察された。
3.培養実験
GT1-7細胞4×10^6個/dishをCRH(10^<-6>,10^<-8>,10^<-10>M)、CRH受容体拮抗薬α-helical CRH(10^<-6>M)を加えて30分間培養し、培養液中のGnRH濃度をRIAにて測定した。CRH添加培養によって培養液中のGnRH濃度は、CRH濃度依存性に増加した。また、このCRHによるGnRH増加は、CRH受容体拮抗薬α-helical CRHを同時に添加するとほぼ完全にブロックされた。このことより、CRHのGT1-7に対する作用はCRH受容体を介するものであることが推察された。
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