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(1)蝸牛外有毛細胞の細胞内塩素イオン濃度の測定
モルモット蝸牛よりコルチ器を摘出する。酵素ならびに機械的処理により、外有毛細胞を単離し、塩素イオン感受性蛍光色素であるMQAEを負荷する。倒立落射蛍光顕微鏡を用いて、細胞形態およびMQAEの蛍光像を観察する。顕微蛍光測光装置を用いて、細胞内塩素イオン濃度の変化を測定する。
(2)電気刺激による外有毛細胞の収縮と細胞内塩素イオン濃度の変化の観察
灌流装置により細胞外液中に試薬を投与し、白金製双極電極により電気刺激を加え、収縮運動時の細胞の形態およびMQAE蛍光強度の変化を観察する。
(3)外有毛細胞の細胞内情報伝達搬構の解明
現在までに、我々は、電気刺激による外有毛細胞の収縮には、ω-コノトキシン感受性カルシウムチャネルを介して細胞外より流入するカルシウムイオンにて活性化される、BK型カリウムチャネルとフロセミド感受性塩素イオンチャネルが各々独立して関与することを解明している。
今回、BK型カリウムチャネルの活性化にカルシウム・カルモデュリンカイネースIIが関与することを確認した。細胞外カルシウムイオンの細胞内流入以後のカリウムチャネルと塩素イオンチャネル活性化までの細胞内情報伝達系の解明をするため、蛋白脱リン酸化を阻害する薬剤であるオカダ酸やカリクリンAおよび蛋白脱リン酸化を促進する薬剤であるセラミド系のN-アセチルスフィンゴシンを使用した。オカダ酸とN-アセチルスフィンゴシンは蝸牛外有毛細胞の電気刺激による収縮に影響を及ぼさなかった。唯一、カリクリンAが電気刺激による外有毛細胞の収縮を阻害した。同時に細胞内塩素イオン濃度の低下も阻害した。
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