|
1.ヒトERα、ERβ遺伝子プロモーターの活性調節を行う物質や因子の検索
ヒトの両ER遺伝子プロモーター配列のPCRによる単離については、増幅条件の最適化が予想外に困難であり、現在も進行中である。そこで、マウスの同遺伝子プロモーターの増幅も同時に試みた。既知のマウスERα遺伝子プロモーターの部分配列をPCR増幅することで得た断片をプローブとして用い、約2.8kbpの断片を得た。また、マウスERβ遺伝子プロモーターについては、mERβ cDNAの5'-末端領域断片をプローブとして同様にスクリーニングを行い、プロモーター領域を含む約1.2 kbpの断片を単離した。次に、得られた各ERサブタイプの遺伝子プロモーターの下流にルシフェラーゼ遺伝子を連結し、さらにneo^r遺伝子を組み入れたレポータープラスミドを構築した。これらを骨芽細胞様細胞株MC3T3-E1に安定的に導入した。これらの細胞に各種ホルモンや薬剤およびフレクサーセルを用いて機械的刺激を加え、細胞を回収した後ルシフェラーゼ活性を測定した。その結果、BMP2、EGF、およびTPAなどは両遺伝子プロモーターを有意に抑制し、実際これらの薬剤はMC3T3-E1細胞において両ERサブタイプmRNAの発現も減弱することが明らかになった。一方機械的刺激の効果は今回の条件設定では認められなかった。この中で、BMP2は骨芽細胞の分化や機能に特異的に関与する因子であるため、さらなる解析を進めた。その結果、BMP2は新規蛋白質合成を介して両ER遺伝子の発現を抑制するが、ERα、ERβ各遺伝子発現の抑制は、それぞれCキナーゼ依存的、非依存的にもたらされることが示された。
2.骨組織特異的なER共役因子の検索
酵母ツーハイブリッドの実験系により、現在までにいくつかのER結合蛋白質の候補遺伝子を得ている。現在これらについてさらなる解析を進めている。
|
