| 研究概要 |
本年は定量RP-PCR法による解析法の確立を行った。歯根嚢胞壁線維芽細胞内で発現しているIL-6 mRNAについて解析し、解析装置はロッシュ社ライトサイクラー(当講座既設)を用いた。定量RT-PCR法は、サンプルの間のmRNAの発現差の解析を目的としており、外部標準遺伝子を用いることで、発現量の絶対値が得られ比較が可能である。しかし、この定量RT-PCR法に用いる外部標準遺伝子は未だに、世界的に確立していない。そこで、今回、申請者は、この外部標準遺伝子として目的の遺伝子を大量生産し、これを用いて定量化を行った。目的の遺伝子は内部標準のPBGD遺伝子とヒトIL-6遺伝子を用いた。ヒトPBGD遺伝子及びヒトIL-6遺伝子は、正常ヒト線維芽細胞から発現しているmRNAを逆転写酵素でcDNAにし、それぞれのプライマーで増幅したPCR産物をTAクローニング法によって、ベクターBluescriptIISK(+)にPCR産物を組み込んだ。まず、ベクターをEcoRVで消化し、ベクターの3'末端にdTを付加し、PBGDのPCR産物を組み込み、さらに、SmaIで消化した後、同様にヒトIL-6遺伝子を組み込み、1つのベクターに内部標準遺伝子とIL-6遺伝子を組み込んだ。ベクターに正確に組み込まれたかどうか確認するためABI PRISM310(当大学既設)を用いて、組み込んだ遺伝子の塩基配列の確認を行った。サイトカイン産生通り、正常歯肉、正常歯根膜に比べ、歯根嚢胞壁線維芽細胞からのIL-6 mRNAの産生は有意に高かった。さらに、転写因子であるNF-IL-6, NF-κB, NF-IL-6βの解析が必要となるが、その上流域であるMAP kinase familyの解析をWestern blotting法(本年度申請品)で解析を試みている。今年は、症例が少なかったため、正常歯肉及び正常歯根膜細胞のついての解析だが、これらの細胞は、歯根嚢胞壁線維芽細胞のoriginになると考えられるため、大変意義のあることとなる。
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