| 研究概要 |
本年度は,人工臓器材料としてのリコンビナントコラーゲン作製のため,導入遺伝子cDNAカセットを作製した.ヒト組織由来cDNAよりデザインしたプライマーを用いてヒトtype I procollagen cDNAを作製した.遺伝子配列を確認後,type I procollagenの8つに分けられたdomain,signal peptide,N-propept-idetelopeptide,D1,D2,D3,D4,D0.4,C-propeptidetelopeptideについてPCR2.1 transformation vector(Invitrogen,U.S.A.)を用いてサブクローニングを行った.それぞれのdomainについて制限酵素配列を持ったプライマーをデザインし,PCR反応を利用してカセットを作製した.
各カセットの遺伝子配列を確認後,三本鎖の一連のD-periodsを限定する4.4ブロックの234アミノ酸と78アミノ酸の一つを欠損させた新規のリコンビナントtype I procollagen cDNAを設計した.
1.N-protelo-D1-D2-D3-D4-D0.4-C-protelo(Full length=type I procollagen)
2.N-protelo-D2-D3-D4-D0.4-C-protelo(-D1)
3.N-protelo-D1-D3-D4-D0.4-C-protelo(-D2)
4.N-protelo-D1-D2-D4-D0.4-C-protelo(-D3)
5.N-protelo-D1-D2-D3-D0.4-C-protelo(-D4)
6.N-protelo-D1-D2-D3-D4-C-protelo(-D0.4)
(protelo:propeptidetelopeptide)
以上の6つのカセットを順次PCR2.1 transformation vector内で構築した.
今後は,構築したカセットcDNAをtransfection vectorに移し,哺乳動物細胞に遺伝子導入,リコンビナント蛋白の抽出,精製を行い,安定したリコンビナント発現系の開発を行う.そして各蛋白について生化学的解析,温度安定性などについて解明していくことを計画している.
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