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本年度は、まずラット腹水ガン細胞由来S-IIの大量精製法を確立した。S-IIを発現する大腸菌をファメンターで大量に培養し、凍結融解により菌体を破砕して目的タンパク質を可溶性画分に得た。オープンカラムシステムを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー、HPLCシステムを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー、等電点クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィーによる精製方法の検討と最適化を行い、SDS電気泳動により単一の分子量を示すまで目的タンパク質を精製できる方法を確立した。大量精製法によって得られたタンパク質試料は、ゲルろ過クロマトグラフィーによる分析でモノマーであることを確認し、またMALDI TOFMSにより決定した分子量がアミノ酸配列から計算される値と誤差の範囲内で一致したことから翻訳後修飾は受けていないことも明らかにした。このタンパク質試料を用いて結晶化条件を探索したところ、再現性が低いながらも三次元結晶の前段階と考えられる球晶が成長する条件をいくつか発見した。球晶が成長する結晶化条件には微酸性かつ高イオン強度という共通した特徴があった。そのため微酸性かつ高イオン強度という条件がタンパク質の三次元構造を安定に保つのに重要と考え、精製方法を全面的に見直した。低イオン強度かつ高pHの条件となる等電点クロマトグラフィーの代わりに高イオン強度の条件下にタンパク質試料を保つことができる疎水クロマトグラフィーを使い、かつ精製操作全般を厳密に微酸性条件下で行うように精製方法を変更することで、SDS電気泳動により単一の分子量を示す程度まで目的タンパク質を精製できる別の新しい方法を確立した。その結果得られた新しいタンパク質試料からは球晶が再現性良く生じるようになった。現在はX線解析に適した単結晶が成長するように結晶化条件の最適化を行っている。
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