モノリティック型カラムを用いたCEC法による生体試料の分離分析法の確立

2002 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 13771359
• 研究機関: 静岡県立大学
• 研究代表者: 加藤 大 静岡県立大学, 薬学部, 講師 (30332943)
• キーワード: キャピラリー電気クロマトグラフィー / マイクロチップ / ゾルーゲル反応 / 生体分子 / ハイスループットスクリーニング / モノリス構造 / ナノ構造 / 分子認識

研究概要

昨年度は、マイクロ・ナノメートルスケールで構造が制御されたモノリティック体を合成し、その微細構造の最適化を行うことで優れた分離能を示すモノリティック型カラムの作製に成功した。しかしながら生体成分のような極性の高い化合物の分析に利用すると、モノリティック体表面に存在するシラノール基に極性の高い化合物が吸着してしまうため、ピークのテーリングが観察され、良好な分離を得ることができなかった。そこで今年度は、シラノール基を減少させるために、表面を化学修飾することにした。化学修飾には、ジメチルオクタデシルクロロシラン(1)とクロロトリメチルシラン(2)とを用いた。1と2の双方で化学修飾したモノリティック型カラムが、最も優れた分離能を示した。修飾したカラムを用いて、ラットの脳脊髄液中のアミノ酸分析を行った結果、5分程度でGlnとSerの測定を行うことができた。
さらにモノリティック型カラムにナノメートルサイズの空間を作製し、その中にタンパク質を包含させることに成功した。生理的な条件下でカラムを作製すると、包含されたタンパク質はその構造や活性を保持していた。実際にウシ血清アルブミンを固定化したカラムでは、アルブミンに親和性を持つ化合物ほど、カラムに強く保持された。さらにトリプシンを固定化したカラムでは、トリプシンによる消化反応に引き続いて、原料と生成物との分離を1本のカラムで行うことに成功した。このタンパク質の包含法は、様々な形状の空間にタンパク質を包含することができ、実際にマイクロチップ上にもタンパク質を固定化し、その機能を発現することに成功した。

研究成果

• [文献書誌] K.Sakai-Kato, M.Kato, T.Toyo'oka: "On-line drug-metabolism system using microsomes encapsulated in a capillary by the sol-gel method and integrated into capillary electrophoresis"Anal. Biochem.. 308. 278-284 (2002)
• [文献書誌] M.Kato, K.Sakai-Kato, N.Matsumoto, T.Toyo'oka: "A protein-encapsulation technique by the sol-gel method for the preparation of monolithic columns for capillary electrochromatography"Anal. Chem.. 74. 1915-1921 (2002)
• [文献書誌] K.Sakai-Kato, M.Kato, T.Toyo'oka: "On-line trypsin-encapsulated enzyme reactor by the sol-gel method integrated into capillary electrophoresis"Anal. Chem.. 74. 2943-2949 (2002)
• [文献書誌] M.Kato, K.Sakai-Kato, T.Toyo'oka, M.T.Dulay, J.P.Quirino, et al.: "Effect of preparatory conditions on the performance of photopolymerized sol-gel monoliths for capillary electrochromatography"J. Chromatogr. A. 961. 45-51 (2002)
• [文献書誌] M.Kato, N.Matsumoto, K.Sakai-Kato, T.Toyo'oka: "Investigation of chromatographic performances and binding characteristics of BSA-encapsulated capillary column prepared by the sol-gel method"J. Pharm. Biomed. Anal.. 30. 1845-1850 (2003)
• [文献書誌] K.Sakai-Kato, M.Kato, T.Toyo'oka: "Creation of an on-chip enzyme reactor by encapsulating trypsin In sol-gel on a plastic microchip"Anal. Chem.. 75. 388-393 (2003)