| 研究概要 |
Cyan fluorescent protein(CFP)及びyellow fluorescent protein(YFP)を用いて蛍光共鳴エネルギー遷移(fluorescent resonance energy transfer, FRET)を利用したチロシンリン酸化検出プローブを作製した。CFPとYFPの間にGrb2/Ash由来のsrc homology(SH)2ドメイン、Shcの被リン酸化チロシンを含む領域21残基をつないだ融合タンパク質(CFP-Ash-Shc-YFP)はShc部分がチロシンリン酸化されるとコンフォメーションが変化し、その結果FRET効率が変化する。
この融合タンパク質をHeLa細胞に発現させ、バナジウムでチロシンリン酸化を元進させた。抗GFP抗体、抗リン酸化チロシン抗体を用いたウェスタンブロットより、融合タンパク質が細胞内に発現しており、バナジウム刺激に伴ってチロシン残基がリン酸化されていることが確認された。またこの融合タンパク質は、433nmの励起により475nm、527nmに極大を持つ蛍光スペクトルを示し、チロシンリン酸化によってFRET効率が変化(475nmの蛍光の上昇、527nmの蛍光の減少)した。意図した通り、チロシンリン酸化を蛍光変化として捕らえることに成功した。
Ash-Shc間のリンカー部分の長さを変化させてチロシンリン酸化検出能力を検討したところ、大きな蛍光変化を示すためにはある程度の長さのリンカーが必要であることが示された。SH2ドメインとリン酸化チロシンが分子内結合する際の立体障害を軽減するため、リンカー部分に柔軟性が必要なためと考えられる。EFGSGSGSGSG、EFCSRRYRGPGISSSSPAGという配列をリンカーとして用いた時に良好な結果を得た。
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