ハロバクテリアのセンサーロドプシン葬の3次元構造

2001 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 13780483
• 研究種目: 奨励研究(A)
• 研究機関: 岡山大学
• 研究代表者: 大塚 正人 岡山大学, 薬学部, 助手 (30243489)
• キーワード: センサーロドプシン / 膜タンパク質 / 大量発現

研究概要

以下の項目の研究を行い、以下の結果を得た。
これまでに確立したSR IIの大量発現系をもとに、Htr IIのハロバクテリアにおける機能的な大量発現系の確立を行なった。ハロバクテリアの野生株ゲノム遺伝子より、Htr IIをコードする遺伝子htr IIをflanking領域を含めてクローニングし、発現ベクターに導入した。このプラスミドを用いて、4種のロドプシンを完全に欠損した変異体を宿主としHtr IIの大量発現系を構築した。具体的にはプロモーターとしてBRのプロモーターである、boPプロモーターを用い、その下流にhtr IIをつなぐことで過剰発現できた。Htr IIの大量発現系では、2種の発現ベクターを作成した。すなわち、HTR IIをBRのleader sequenceと融合させたものとleadersequenceと融合させていないものである。これらの形質転換体を単離後、発現量の差異について検討した。組み換え蛋白質の精製を簡略化するために、同蛋白質のカルボキシル基末端には6つのヒスチジンオリゴマーを融合させた。大量発現されたHtr IIは可溶化後、Ni-NTA Agaroseを用いたアフィニィークロマトグラフィーで精製する予定である。また、SR IIとHtr IIを同時に過剰発現させる系をハロバクテリア中で構築する予定である。大量発現した蛋白質はHtr IIの場合と同様に精製・単離する予定である。

研究成果

• [文献書誌] H.Yamada, M.Otsuka, M.Hayashi, K.Hamaguchi, A.Yamamoto, Y.Moriyama: "Ca^<2+>-dependent exocytosis of L-glutamate by αTC6, clonal mouse pancreatic α cells"Diabetes. 50. 1012-1020 (2001)
• [文献書誌] Lutz I, Sieg A, Wegner AA, Engelhard M, Boche I, Otsuka M, Oesterhelt D, Wachtveitl J, Zinth W.: "Primary reactions of sensory rhodopsins"Proc Natl Acad Sci USA.. 98. 962-967 (2001)
• [文献書誌] S.Nakatsuka, M.Hayashi, A.Muroyama, M.Otsuka, S.Kozaki, H.Yamada, Y.Moriyama: "D-Aspartate is stored in secretory granules and released through a Ca^<2+>-dependent pathway in a subset of rat pheochromocytoma PC 12 cells"J. Biol. Chem.. 356. 26589-26596 (2001)
• [文献書誌] M.Hayashi, M.Otsuka, R.Morimoto, S.Hirota, S.Yatsuhiro, J.Takeda, A.Yamamoto, Y.Moriyama: "Differentiation-associated Na^+-dependent inorganic phosphate cotransporter (DNPI) is a vesicular glutamate transporter in endocrine glutamatergic systems"J Biol Chem.. 276. 43400-43406 (2001)