| 研究概要 |
MCM(minichromosome maintenance)蛋白質群はゲノム複製の開始に中心的な役割を果たし、DNAヘリカーゼの活性をもつ複製許可因子でもある。真核細胞の複製開始機構の本質を明らかにするために、ヘリカーゼ活性の詳細を分子レベルで明らかにする目標をたて、MCMの生化学的解析を進めている。
1.DNAヘリカーゼ活性発現におけるMCM4,6,7の機能分担の同定
MCM4,6,7のすべてにATPaseのドメインとZinc-fingerモチーフが存在する。そこで、これらの特徴的ドメインに変異を導入し、MCM4,6,7複合体を精製し、ヘリカーゼ活性を測定した。MCM7に変異を持ったMCM4,6,7複合体ではATPase活性とヘリカーゼ活性が著しく減少することを見出した。即ち、MCM7はサブ活性の内ATP加水分解活性に重要な役割を果たすことが判明した。さらに、MCM4の変異複合体ではサブ活性内の一本鎖DNA結合活性が減少したが、ヘリカーゼ活性が増加する結果を得た。MCM4のZinc-fingerドメインがDNA-蛋白質の相互作用に関与することが示唆された。私はすでにマウスMCM6はATP結合活性に重要な役割を果たすことを見出している。以上の結果より、ヘリカーゼ活性におけるMCM4、6と7の役割分担が解き明かされ、2本鎖DNAの解離機構のモデルを提示するに至った。
2.マウスMCMの複製フォーク内でのヘリカーゼ機能の同定
複製フォークの構造に類似した基質を調製し、DNAヘリカーゼ活性への影響を検討した。tailとして持つと持たない基質を作製し、MCM4,6,7のDNAヘリカーゼ活性を調べたところ、前者において活性が高くなることを見出した。この結果から、tailを持つ基質はprocessive DNAヘリカーゼ活性に必要であることが示唆された。複製フォークの構造を類似した基質をデザインし、mMCM4,6,7のgel-shift assayを行ったところ、2分子のmMCM4,6,7六量体が基質と結合することを見出した。さらに、Sequenaseを用いて、mMCM4,6,7DNAヘリカーゼのprocessivityを調べた。一本鎖DNA結合蛋白質であるhRPAの存在下では、mMCM4,6,7ヘリカーゼのprocessivityが4倍ぐらい促進された。以上の結果より、マウスMCM4,6,7がDNA複製フォークでDNAヘリカーゼとして機能することを示唆することができた。
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