| 研究概要 |
哺乳類細胞のDNA複製装置複合体の分子構築を明らかとするために1)酵母Two-hybrid法によりDNA複製装置複合体構成因子間の蛋白質相互作用を系統的に解析し、2)クロマチン結合因子検出法によりactiveなpre-replicative complexや複製フォークに含まれる因子の性質解析を進め、3)培養細胞中での局在部位を蛍光抗体法により検討した。20種類以上の複製関連因子のcDNAをbaitとした酵母two-hybrid法によるスクリーニングを行い、未知因子を含む多数の複製因子候補を単離した。また、これらの結合因子間の相互作用を系統的に検討した結果、MCM10-MCM2,4,6,MCM10-Orc2,MCM10-DNA polymerase α,Cdt1-MCM6,Cdt1-geminin, SAP18-DNA polymerase ε等の興味深い相互作用を検出した。クロマチン結合タンパク質分画法により、これらの因子の細胞内局在部位を検討した結果、MCM10が複製開始から伸長過程において重要な役割を担うこと、ヒストンデアセチラーゼ複合体に含まれるSAP18がS期においてDNA polymerase εと相互作用すること、等が判明した。さらに細胞染色法により、Mcm2,3,4,Cdc45,DNA polymerase α,ε,PCNA等が複製部位に共局在し、Replication fociに含まれることを見出した。哺乳類細胞の複製装置複合体に含まれる因子の同定と機能について示唆し得る結果が得られた。現在地の複製因子候補との相互作用を培養細胞内もしくはin vitroのレベルで検討しており、複製装置複合体の再構築目指している。
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