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V(D)J組み換え酵素RAG2の全長タンパク質を精製しその機能解析行うため、昨年度は改良型無細胞タンパク質合成法での発現に成功したが、得られた精製タンパク質は活性を有さなかった。そこで今年度はメタノール資化酵母、Pichia pastorisを使った系を採用し全長RAG2タンパク質の精製を試みた。Pichia pastorisはタンパク質の大量発現を簡便かつ低コストで達成できる発現系として知られている。成功すれば構造解析や点変異体の解析への応用も期待できるため本方法を採用した。まず、メタノールで発現を誘導できるAOX1プロモーターを有するpPICベクターに全長RAG2遺伝子をN末にHis x6タグ、C末にmycタグをつけた形でサブクローニングした。次にこのベクターを相同組み換えでPichia pastorisゲノムに導入し、マーカーによる選択で組み換え酵母を作成した。メタノール添加により誘導すると、RAG2タンパク質の発現が認められた。Ni-NTAカラムによりタンパク質を精製し、これを用いてDNA切断活性を行った結果、特異的切断の検出に成功した。Hela細胞より精製したC末を欠くRAG2のDNA結合活性・切断活性と比較してPichia pastoris由来全長RAG2タンパク質の切断活性は決して高くはないが、培養細胞を用いた系より簡単にスケールを増やせるので今後は精製方法を改良し、組み換えシグナル配列の微妙な相違点の認識や順序の制御、及びDNA修復にも関与すると思われるC末側の機能解析を行う予定である。
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