| 研究概要 |
耐熱・耐酸素性に優れるHydrogenovibrio marinusの膜結合型ヒドロゲナーゼ(MBH)では、活性サブユニット(大サブユニット)のIle残基の割合が高い。このような特徴と高い安定性との関連を解析するために、本酵素と高い相同性(72%Identity,83%Similarity)をもつが安定性は大きく異なるRalstonia eutrophaのMBH大サブユニット(HoxG)に部位特異的なIle残基の導入を検討した。R.eutrophaの野生型hoxG遺伝子を鋳型として、2step PCR法によって変異型hoxG遺伝子の部分断片を調製した。シークエンスを確認した後、スーサイドベクターpLO3に載せ、接合伝達によってR.eutrophaへ導入した。pLO3に存在するTc耐性遺伝子とsacB遺伝子をマーカーとして、ゲノム上の野生型hoxGと導入された変異型hoxG部分断片との間で相同組み換えが生じた変異株を選抜した。HoxG[V115I](M1変異)、HoxG[P181I](M2)、HoxG[L243I](M3)、HoxG[V253I](M4)、HoxG[N168I,L170I](M5)、HoxG[V115I,A119I](M6)の6つ変異型MBHの作成に成功し、今後安定性の詳細な解析を行う。また、構造遺伝子下流域の解析を進め、大サブユニット遺伝子下流にシトクロムb様の配列(228bp)をコードするORFが、さらにその下流にはデータベース上に有意な相同タンパク質が見られないORF(ORF1,252bp)が確認された。このORF1は4つの膜貫通ドメインをもつ膜タンパク質であることが予測され、ヘムc結合モチーフが存在することからヒドロゲナーゼ反応を介したATP生産に関与する新規の電子伝達タンパク質である可能性がある。
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