2003 年度実績報告書

酵素タンパクの戦略的耐熱化・有機溶媒耐性化研究

研究課題

研究課題/領域番号	13836004
研究機関	信州大学
研究代表者	八森章信州大学, 繊維学部, 教授 (30082811)
研究分担者	内海利男新潟大学, 理学部, 教授 (50143764)
キーワード	大腸菌 / 無機ピロフォスファターゼ / 熱安定性 / 有機溶媒耐性 / 部位特異的変異 / 枯草菌
研究概要	遺伝子工学的、タンパク質化学的、酵素学的手法を用いて、本研究により次のことを明らかにした 1)Family II PPase無機ピロフォスファターゼ(PPase)13種類に共通して存在するKKR配列(枯草菌PPaseでは295Kから297R)前2者のKKは触媒活性中心、特に基質認識に重要であることを明らかにした。また、3番目のRは基質が通過する通路の大きさを整えている推定された。 2)Family II PPaseは2量体で存在し、サブユニットあたりマンガンイオン3分子が配位していることを明らかにした。 3)枯草菌PPaseの2つのドメイン(1-187、193-323)を結ぶヒンジ領域は機能発現に重要であり、189Gはその中でも特に重要な機能を有している。 4)Family I PPaseに属する好熱菌PPaseの12個のプロリン残基のうち外部環境接触面に存在するものは機能発現に何の影響ももっていないが、その他の残基はサブユニット間相互作用に多かれ少なかれ影響を有する。特に72番目のプロリンは6量体形成に決定的役割をもっており、その変異体は単量体でしか存在できない。 5)酵素タンパク質の安定性・有機溶剤耐性はタンパク分子の(1)外部親水性、(2)内部疎水性と充填性、(3)ヘリックス安定性、(4)サブユニット間相互作用に依存している。大腸菌PPaseの一次構造と、その一次構造が類似している7種の好熱菌PPaseの一次構造と比較し、7種の好熱菌PPaseに共通して保存されているが大腸菌PPaseでは異なっているアミノ酸残基を好熱菌型に置換し、タンパク質の安定化、有機溶剤耐性化向上を目指す事をめざした。現在までF40K, Y571, P741, Q80L, S111Eの変異体を作製し、疎水クロマトグラフィーにより電気泳動的に単一な標品を得た。これら標品について酵素学的特性と、変異導入によるタンパクの高次構造に及ぼす影響を検討した。

研究成果
(6件)

すべてその他

すべて文献書誌 (6件)

[文献書誌] Nomura, T., Hachimori, A., Uchiumi, T.et al.: "A point mutation in ribosomalprotein L7/L12 reduce its ability to form a compact dimmer structureand to assemble into GTPase center"Biochemistry. 42. 4691-4698 (2003)
[文献書誌] Nishiyama, T., Hachimori, A., Uchiumi, T., Nakashima, N: "Structural elements in the internal ribosome entry site of Plautia stali intestine virus responsible for binding with ribosomes"Nucleic Acids Res.. 31. 2434-2442 (2003)
[文献書誌] Masuda, H., Uchiumi, T., Hachimori, A.: "Effects of replacement of prolines with alanines on the catalytic activity and thermostability of inorganic pyrophosphatase from thermophilic bacterium PS-3"J. Biochem.. 131. 53-58 (2002)
[文献書誌] Uchiumi, T., Honnma, S., Hachimori, A.: "Translation elogation by a hybrid ribsome in which proteins at the GTPase center of the Escherichia coli ribosome are replaced with rat counterparts"J.Biol.Chem.. 277. 3857-3862 (2002)
[文献書誌] Hachimori, A., Baykov, A.A., Lapti, R: "Quaternary structure and metal ion requirement of family 2 pyrophosphatases from B. subtilis, S. gordonii, and S. mutans."J.Biol.Chem.. 276. 24511-24518 (2001)
[文献書誌] Shizawa, N., Uchiumi, T., Hachimori, A: "Directed mutagenesis studies of the C-terminal fingerprint region of Bacillus subtilis pyrophosphatase"Eur.J.Biochem.. 268. 1-4 (2001)

2003 年度 実績報告書

酵素タンパクの戦略的耐熱化・有機溶媒耐性化研究

研究代表者

八森 章 信州大学, 繊維学部, 教授 (30082811)

研究成果

[文献書誌] Nomura, T., Hachimori, A., Uchiumi, T.et al.: "A point mutation in ribosomalprotein L7/L12 reduce its ability to form a compact dimmer structureand to assemble into GTPase center"Biochemistry. 42. 4691-4698 (2003)

[文献書誌] Nishiyama, T., Hachimori, A., Uchiumi, T., Nakashima, N: "Structural elements in the internal ribosome entry site of Plautia stali intestine virus responsible for binding with ribosomes"Nucleic Acids Res.. 31. 2434-2442 (2003)

[文献書誌] Masuda, H., Uchiumi, T., Hachimori, A.: "Effects of replacement of prolines with alanines on the catalytic activity and thermostability of inorganic pyrophosphatase from thermophilic bacterium PS-3"J. Biochem.. 131. 53-58 (2002)

[文献書誌] Uchiumi, T., Honnma, S., Hachimori, A.: "Translation elogation by a hybrid ribsome in which proteins at the GTPase center of the Escherichia coli ribosome are replaced with rat counterparts"J.Biol.Chem.. 277. 3857-3862 (2002)

[文献書誌] Hachimori, A., Baykov, A.A., Lapti, R: "Quaternary structure and metal ion requirement of family 2 pyrophosphatases from B. subtilis, S. gordonii, and S. mutans."J.Biol.Chem.. 276. 24511-24518 (2001)

[文献書誌] Shizawa, N., Uchiumi, T., Hachimori, A: "Directed mutagenesis studies of the C-terminal fingerprint region of Bacillus subtilis pyrophosphatase"Eur.J.Biochem.. 268. 1-4 (2001)

2003 年度実績報告書

八森章信州大学, 繊維学部, 教授 (30082811)