| 研究課題/領域番号 |
13836008
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| 研究機関 | 岡山大学 |
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研究代表者 |
酒井 裕 岡山大学, 工学部, 教授 (60089117)
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| 研究分担者 |
山際 雅詩 岡山大学, 工学部, 助手 (00325078)
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| キーワード | Bacillus thuringiensis / Cry11A / 特異的殺虫タンパク質 / Cry4A / 双翅目昆虫 / アカイエカ |
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| 研究概要 |
Bacillus thuringiensisが産生する双翅目昆虫特異的殺虫蛋白質の一つであるCry11Aのプロトキシン(70kDa)のプロセシング過程をin vitro及びin vivoで調べた。70kDaプロトキシンをトリプシンで消化したところ、36kDaと32kDa断片が生成した。アカイエカ幼虫(ボウフラ)より調製した中腸抽出液を用いて処理した場合にも類似の結果が得られた。また、Cry11Aがアカイエカ幼虫に摂食された場合、中腸内では30kDaと28kDaの断片の生成が認められた。これは中腸内においてはトリプシン様プロテアーゼの他にも別のプロテアーゼが存在するためにより低分子化すると考えられる。生じたポリペプチド断片のN末端領域のアミノ酸配列を解析し、36kDa断片のN末端アミノ酸はSer10であり、32kDa断片のN末端アミノ酸はAsp361である事を明らかにし、両断片が70kDaプロトキシンの分子内切断により生成することを示した。さらにこれら二つの断片はゲルろ過及びイオン交換クロマトグラフィーにおいて同一画分に溶出されたことから36kDaと32kDa断片は会合し複合体を形成している可能性が考えられた。このことは後述の融合蛋白質GST11A-36kと32k-Hisが会合体を形成することが確認されたことによって実証された。この複合体がBBMV結合能を有し、またボウフラに対する十分な殺虫活性を保持していたことから36kDaと32kDa断片からなる複合体がCry11Aの可能な活性型分子の一つの形態であることが強く示唆された。36kDaと32kDaの各断片を融合蛋白質GST11A-36k、GST11A-32k及び32k-Hisとして発現する発現ベクターを構築し、大腸菌に導入、発現させて精製した。GST11A-36kとGST11A-32kは、それぞれ単独ではボウフラに対する殺虫活性を持たないことが明らかとなり、36kDaと32kDaの会合体形成によって殺虫活性が発現することが強く示唆された。さらに、ボウフラBBMVにCry11A特異的結合蛋白質の存在を明らかにし、またもう一つの双翅目特異的殺虫蛋白質であるCry4Aとは標的細胞上の結合部位を共有していない事を示唆した。
以上の通り本研究では、Cry11Aの特徴的な活性化過程、活性型分子種の一つ、及び特異的結合蛋白質の存在を明らかにした。
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