| 研究課題/領域番号 |
13854003
|
|---|
| 研究機関 | 東京大学 |
|---|
研究代表者 |
長棟 輝行 東京大学, 大学院・工学系研究科, 教授 (20124373)
|
|---|
| 研究分担者 |
河原 正浩 東京大学, 大学院・工学系研究科, 助手 (50345097)
新海 政重 東京大学, 大学院・工学系研究科, 講師 (70262889)
上田 宏 東京大学, 大学院・工学系研究科, 助教授 (60232758)
|
|---|
| キーワード | 抗体 / 受容体 / ライブラリー / 抗体生産 / プロテインチップ |
|---|
| 研究概要 |
既往の研究において、エリスロポエチン受容体(EpoR)のEpo結合ドメインを抗フルオレセイン(Fl)抗体のScFvで置換し、その細胞内ドメインをIL-6受容体β鎖であるgp130で置換したキメラ受容体(ScFV-gp130)が、Fl標識BSA(BSA-Fl)、もしくはFl dimerに応答して増殖シグナルを伝達することを示した。この応用として、高親和性抗体の選択と分泌生産を同一細胞を用いて行える系の確立を目指した。本年度は、抗体部分は前述の抗Fl抗体を用い、抗体-受容体キメラを遺伝子導入後、キメラ発現細胞のみを選択的に増幅し、Cre-loxP組換えによって抗体分泌細胞に変換するシステムの構築を行った。まず、キメラ受容体遺伝子部分の前後にloxP配列を挿入し、組換えが起こるとHismycタグがついたScFvが培養上清に分泌されるようなベクターをデザインした。また、解析を容易にするために、組換え前にはGFPを発現するが組換えが生じるとGFP遺伝子部分が除去されて発現されなくなるようにした。具体的には、抗Fl抗体ScFvとEpoRの細胞外ドメインとのリンカー部分としてloxP配列が翻訳されるエキソン型と、余分なloxPリンカー配列によって受容体の機能が損なわれるのを防ぐために、loxP配列をScFvとEpoR間のイントロンに挿入したイントロン型の2種類を作製した。これらのベクターをIL-3依存性血球細胞株Ba/F3、FDC-Plに遺伝子導入し、BSA-Flを添加して選択した。その結果、エキソン型、イントロン型いずれのキメラ受容体発現細胞もGFP陽性細胞のみを選択することができた。続いて、選択後の細胞にCre発現ベクターをレトロウィルスによって導入した結果、組換えが示唆されるGFP陰性細胞が一部得られた。この細胞をフローサイトメーターでソーティングしてゲノムDNAを解析した結果、確かに組換えが生じていることを確認した。そこで、培養上清から免疫沈降でScFvを回収することを試み、Western Blottingで解析した結果、確かにScFvが培養上清に分泌されていることが確認できた。以上より、抗体の選択から分泌生産までを一貫して行えるシステムが確立できたといえる。今後はキメラ受容体のScFv部分をライブラリー化し、目的抗原結合性抗体断片のスクリーニング-分泌系を構築していく予定である。
|
