葉緑体in vitro RNAエディティング・翻訳共役系の確立

2003 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 13874111
• 研究機関: 名古屋市立大学
• 研究代表者: 杉浦 昌弘 名古屋市立大学, 大学院・システム自然科学研究科, 教授 (80027044)
• キーワード: 葉緑体 / in vitro系 / RNAエディティング / 翻訳 / タバコ / エンドウ / mRNA

研究概要

高等植物の葉緑体の転写産物では、CからUへのRNAエディティングにより一部の配列が変化する。その中で、ACGがAUGに変化して翻訳開始コドンを生じる。このエディティングから翻訳開始までの分子機構を解析する手法としてRNAエディティングと翻訳を連動して行うin vitro系の開発のため以下の研究を行った。
1.In vitro系の改良
昨年度は葉緑体in vitroRNAエディティング系の大幅な改良を行ったが、この系はP32標識mRNA基質を用いる。この基質調製が煩雑なため、より簡単な非アイソトープ法の開発を行った。蛍光標識ダイデオキシヌクレオチドとプライマー伸長法を組み合わせ効率よくアッセイできる手法が出来上がった。一方の、in vitro翻訳系の方も非アイソトープ化を進め、蛍光タンパク質mRNAを目的の葉緑体mRNAの後方に結合させ、翻訳産物を蛍光強度でアッセイする手法も完成した。上記の両in vitro系を一緒にして、RNAエディティングと翻訳の共役系の確立をめざしたが、両系の調製液の組成と反応組成が異なるため、充分活性のある共役系がまだ得られていない。
2.In vitro系に適した植物種の探索
一貫して最も解析の進んでいるタバコを使用してきたが、エンドウ葉緑体よりin vitroRNAエディティング系の開発をしたが、RNアーゼ活性が高いため、in vitro翻訳系の開発には適していないことが明らかになった。そこでキュウリ葉緑体についてin vitro系開発の適合性の調査を行ったが、充分な結果を出すまでには得られなかった。

研究成果

• [文献書誌] Sugiura, M.: "History of chloroplast genomics."Photosynthesis Research. 76. 371-377 (2003)
• [文献書誌] Hasegawa, K.: "A tRNA^<Lew>-like sequence located immediately upstream of an Arabidopsis clock-regulated gene is transcriptionally active."Gene. 307. 133-139 (2003)
• [文献書誌] Nakamura, T.: "Array-based analysis on tobacco plastid transcripts : preparation of a genomic microarray containing all genes and al intergenic regions."Plant Cell Physiology. 44. 861-867 (2003)
• [文献書誌] Cloix, C.: "In vitro analysis of sequences required for transcription of the Arabidopsis thaliana 5S rRNA genes."Plant Journal. 35. 251-261 (2003)
• [文献書誌] Miyamoto, T.: "A site-specific factor interacts directly with its cognate RNA editing site in chloroplast transcripts."Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 101. 48-52 (2004)
• [文献書誌] Hirose, T.: "Functional Shine-Dalgarno-like sequences for translational initiation of chloroplast mRNAs."Plant Cell Physiology. 45. 114-117 (2004)
• [文献書誌] Yukawa, Y.: "In vitro transcription system from BY-2 cells. In "Biotechnology in Agriculture and Forestry", vol."BY-2 Cells""Springer. (2003)