2002 年度実績報告書

バキュロウイルス感染細胞を利用した無細胞蛋白質生産系の構築

研究課題

研究課題/領域番号	13876014
研究機関	三重大学
研究代表者	小林淳三重大学, 工学部, 助教授 (70242930)
キーワード	バキュロウイルスベクター / 昆虫細胞 / N型糖鎖 / カイコ / 無細胞蛋白質生産系 / DNAマイクロアレイ / 分子シャペロン
研究概要	バキュロウイルス感染細胞から翻訳後修飾が可能な無細胞蛋白質生産系を構築するための基礎的技術開発を目的として、N型糖鎖付加修飾反応に焦点を絞り、まず使用する昆虫細胞の選定を行った。組換え糖蛋白質(PTTH)を数種バキュロウイルスベクター系で発現させ、付加される糖鎖の主要な構造をレクチンブロットなどで比較検討したところ、High Five細胞では、アレルゲンとなるコアα1,3フコースの分岐が比較的多いことと、サクサン細胞ではわずかに複合型糖鎖の付加がおこるなど若干の細胞間差異があるものの、いずれの鱗翅目昆虫細胞でも末端マンノースとコアα1,6フコースの分岐を有する構造が主体であった。そこで、ウイルスと細胞の両方のゲノム情報が最も豊富なカイコ核多角体病ウイルス(BmNPV)とBmN4細胞を実験材料に供試して研究をすすめることにした。その手始めとしてDNAマイクロアレイを使用して、BmN4細胞と別のカイコ培養細胞BoMoの遺伝子発現パターンを網羅的に比較したところ、想像以上に多くの違いが認められ、この違いが細胞株間の翻訳後修飾特性の差を生み出していると考察された。 BmNPVにおけるvery lateプロモーターからの糖蛋白質生産パターンの解析を容易にするために、バキュロウイルスにおける生産効率の高いラブドウイルスIHNVの表面膜糖蛋白質遺伝子の膜結合領域以降をコードする配列をヘキサヒスチジンタグ配列に置換したcDNAを作製し、BmNPV感染BmN4細胞で発現させたところ、分泌されずにゴルジ体で不溶化することが、糖鎖構造の解析と共焦点顕微鏡による免疫組織化学で明らかになった。この不溶化回避に有効な分子シャペロンの探索が今後の無細胞蛋白質生産系構築に必要な課題として残された。

研究成果

(6件)

すべてその他

すべて文献書誌 (6件)

[文献書誌] Jun Kobayashi, et al.: "Nucleotide sequence analysis of the polyhedrin gene of Antheraea pernyi nucleopolyhedrovirus and construction of transfer vector plasmid"International Journal of Wild Silkmoth & Silk. 6. 53-58 (2001)
[文献書誌] Huang Yuan Jiao, et al.: "Efficiency of Antheraea pernyi nucleopolyhedrovirus-mediated protein production in both established cell line and diapausing pupae of A. perny"International Journal of Wild Silkmoth & Silk. 6. 59-71 (2001)
[文献書誌] Huang Yuan Jiao, et al.: "Genome mapping and gene analysis of Antheraea pernyi nucleopolyhedrovirus for improvement of baculovirus expression vector system"Journal of Bioscience and Bioengineering. 93. 183-191 (2002)
[文献書誌] Jun Kobayashi: "Diapausing pupa of wild silkmoths as an ideal model of bioreactor"International Journal of Wild Silkmoth & Silk. 7. 37-41 (2002)
[文献書誌] Masahiro Nagaya, et al.: "Evaluation of N-glycosylation property of cultured Antheraea pernyi cells in comparison with four other lepidopteran cell lines used in bacylovirus expression vector systems"International Journal of Wild Silkmoth & Silk. 7. 59-68 (2002)
[文献書誌] 小林淳: "昆虫学大事典(三橋淳編)"朝倉書店. 1200 (2003)

2002 年度 実績報告書

バキュロウイルス感染細胞を利用した無細胞蛋白質生産系の構築

研究代表者

小林 淳 三重大学, 工学部, 助教授 (70242930)

研究成果

[文献書誌] Jun Kobayashi, et al.: "Nucleotide sequence analysis of the polyhedrin gene of Antheraea pernyi nucleopolyhedrovirus and construction of transfer vector plasmid"International Journal of Wild Silkmoth & Silk. 6. 53-58 (2001)

[文献書誌] Huang Yuan Jiao, et al.: "Efficiency of Antheraea pernyi nucleopolyhedrovirus-mediated protein production in both established cell line and diapausing pupae of A. perny"International Journal of Wild Silkmoth & Silk. 6. 59-71 (2001)

[文献書誌] Huang Yuan Jiao, et al.: "Genome mapping and gene analysis of Antheraea pernyi nucleopolyhedrovirus for improvement of baculovirus expression vector system"Journal of Bioscience and Bioengineering. 93. 183-191 (2002)

[文献書誌] Jun Kobayashi: "Diapausing pupa of wild silkmoths as an ideal model of bioreactor"International Journal of Wild Silkmoth & Silk. 7. 37-41 (2002)

[文献書誌] Masahiro Nagaya, et al.: "Evaluation of N-glycosylation property of cultured Antheraea pernyi cells in comparison with four other lepidopteran cell lines used in bacylovirus expression vector systems"International Journal of Wild Silkmoth & Silk. 7. 59-68 (2002)

[文献書誌] 小林 淳: "昆虫学大事典(三橋 淳編)"朝倉書店. 1200 (2003)

2002 年度実績報告書

小林淳三重大学, 工学部, 助教授 (70242930)

[文献書誌] 小林淳: "昆虫学大事典(三橋淳編)"朝倉書店. 1200 (2003)