活性中心の改変による新しいグリコシラーゼの作製

2001 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 13876018
• 研究機関: 北海道大学
• 研究代表者: 木村 淳夫 北海道大学, 大学院・農学研究科, 教授 (90186312)
• 研究分担者: 森 春英 北海道大学, 大学院・農学研究科, 助教授 (80241363)
• キーワード: α-グルコシダーゼ / グリコシンターゼ / オリゴ糖合成

研究概要

α-グルコシダーゼは、α-グルコシド結合をもつ基質に作用し、グルコースを遊離させる酵素である。転移反応では、α-グルコシル基を移し、有用な二糖類であるイソマルトースやニゲロースが工業的に生産されている。本酵素は、一次構造や基質認識が異なる2つのグループ(ファミリーIとII)に分類できる。触媒反応は、2つのカルボキシル基(_-COO^-と_-COOH)でなされ、この点では両ファミリーともに共通である。我々は、ファミリーI・II酵素の触媒残基(酸性アミノ酸)を自殺基質法や点突然変異法で決定した。II型酵素の_-COO^-である触媒基AspをAsn・Ala・Glyに置換した変異酵素は、加水分解反応を触媒できないが、活性中心の構造に大きな変化はない。最近、我々は触媒基AspのGly組換え酵素に糖転移活性が存在することを見い出した。本変異酵素は糖転移のみを一方的に行い、転移生成物を分解しない。本研究の目的は、新しく見い出されたこの現象を解析することであり、次に示す研究成果が得られた。(1)Asp→Ala酵素では本現象が認められず、Asp→Gly酵素のみが本反応を触媒した。Alaより小さなアミノ酸残基への置換が有効であった。(2)β-グルコシルフルオリドが第一基質となったが、α-グルコシルフルオリドでは反応が生じなかった。野生型酵素はα-型基質に作用するので、変異酵素の基質認識は逆転していた。従って、反応機構は縮合であると考えられた。(3)第二基質には、p-ニトロフェニル(PNPと略)α-グルコシド、α-キシロシド、α-マンノシドおよびβ-グルコシドが利用された。マルトースやPNPα-ガラクトシドには作用しなかった。PNPα-グルコシドの場合、約70%の高収率でPNPα-マルトシドとα-イソマルトシドが得られた。(4)現在、I型α-グルコシダーゼ、β-グルコシダーゼやα-ガラクトシダーゼについても本現象の解析を行っている。

研究成果

• [文献書誌] H.Mori: "Modulation of Activity and Substrate Binding Modes by Mutation of Single and Double Subsites +1/+2 and -5/-6 of Barley α-Amylase 1"Eur.J.Biochem.. 268・8. 2270-2280 (2001)
• [文献書誌] M.Nishimoto: "Purification and Substrate Specificity of Honeybee, Apismellifera L., α-GlucosidaseIII"Biosci.Biotechnol.Biochem.. 65・7. 1610-1616 (2001)
• [文献書誌] T.Mizuno: "Isolation and Sequence of α-Glucosidase Gene from Brevibacterium fuscum var.dextranlyticum Strain 0407"J.Appl.Glycosci.. 48・3. 287-291 (2001)
• [文献書誌] A.Kimura: "Reaction Mechanism of Glycosylase"Trends In Glycosci.Glycotechnol.. 13. SA-B01J-SA-B01J (2001)
• [文献書誌] J.-H.Lee: "Purification and Identification of Essential Ionizable Groups of Honeybee, Apis mellifera L., Trehalase"Biosci.Biotechnol.Biochem.. 65・12. 2657-2665 (2001)
• [文献書誌] Y.-M.Kim: "Production of Maltopentaose and Biochemical Characterization of Maltopentaose-Forming Amylase"J.Microbiol.Biotechnol.. 11・4. 636-643 (2001)
• [文献書誌] M.Nishimoto: "Study on Three α-Glucosidase Isozymes from Honeybee, Apis mellifera L."J.Appl.Glycosci.. (印刷中). (2002)
• [文献書誌] M.Okuyama: "Catalytic Amino Acid Residue Providing Proton Donar in α-Glucosidase Family II"J.Appl.Glycosci.. (印刷中). (2002)
• [文献書誌] M.Okuyama: "α-Glucosidase Mutant Catalyzes α-Glucosynthase-type Reaction"Biosci.Biotechnol.Biochem.. (印刷中). (2002)
• [文献書誌] T.Takayanagi: "Evaluation of Subsite Affinities of Isomalto-dextranase from Arthrobacter globiformis"J.Appl.Glycosci.. (印刷中). (2002)
• [文献書誌] K.Fukuda: "Kinetic Studies on Substrate Specificity and Active Site of β-D-Glucosidase F_1 from Streptomyces sp."J.Appl.Glycosci.. (印刷中). (2002)