tmRNAによるアミノ酸合成系酵素の発現機構の解析

2001 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 13876019
• 研究種目: 萌芽的研究
• 研究機関: 弘前大学
• 研究代表者: 姫野 俵太 弘前大学, 農学生命科学部, 助教授 (80208785)
• キーワード: tmRNA / トランストランスレーション / metE

研究概要

タグペプチドの配列(AANDENYALAA)を非分解型(AHHHHHHALDD)に変えたtmRNA遺伝子を野生型tmRNA遺伝子と置き換えた大腸菌を作成した。この大腸菌から得られたトランストランスレーション産物は予想通り細胞内で安定になった。ヒスタグが付いているので、ニッケルカラムで精製することが容易である。ニッケルカラム、二次元電気泳動等を用いて、この大腸菌からトランストランスレーション産物である非分解型タグペプチド融合タンパク質を精製する系を確立した。完全培地にて発現してきたタグペプチド融合タンパク質の中で、最も量的に多いものを精製し、そのN末端のアミノ酸配列を調べたところ、metEの産物であることが明らかになった。遺伝子配列から予想されるmetEの産物の全長は分子量85Kdaなのに対してmetE-非分解型タグペプチド融合タンパク質は70Kda程度であったことから、翻訳の途中でトランストランスレーションが起こっていると考えられる。現在、精製したmetE-非分解型タグペプチド融合タンパク質は、いくつかのプロテアーゼで消化した後、それらのC末端断片をニッケルカラムを用いて精製し、MALDI TOF MASSを用いてアミノ酸配列を解析し、metEのどの部分からタグペプチドに置き換わっているのかを調べているところである。
また、栄養素、温度、ストレス等を変化させた様々な条件下において、metE抗体とHisタグ抗体を用いて通常のmetEの発現とmetE-非分解型タグペプチド融合タンパク質の発現パターンを調べる。どのような条件でtmRNAが働き、どのような条件でtmRNAが働かないのかを調べる。

研究成果

• [文献書誌] Lee, S., Ishii, M., Tadaki, T., Muto, A. & Himeno, H.: "Determinants on tmRNA for initiating efficient and precise trans-translation : Some mutations upstream of the tag-encoding sequence of Escherichia coli tmRNA shift the initiation point of trans-translation in vitro"RNA. 7. 999-1012 (2001)
• [文献書誌] Hanawa-Suetsugu, K., Bordeau, V., Himeno, H., Muto, A., Felden, B.: "Importance of the conserved nucleotides around the tRNA-like structure of Escherichia coli transfer-messenger RNA for protein tagging"Nucleic Acids Research. 29. 4663-4673 (2001)
• [文献書誌] Hanawa-Suetsugu, K., Takagi, M., Inokuchi, H., Himeno, H., Muto, A.: "SmpB functions in various steps of trans-translation"Nucleic Acids Research. (印刷中).
• [文献書誌] Fujihara, A., Tomatsu H., Inagaki, S., Tadaki, T., Ushida, C., Himeno, H., Muto, A.: "Detection of tmRNA-mediated trans-translation products in Bacillus subtilis"Genes to Cells. (印刷中).