動物ゲノムのレプリコン構造解明のためのDNA複製部位可視化法の開発

2001 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 13878121
• 研究機関: 三重大学
• 研究代表者: 奥村 克純 三重大学, 生物資源学部, 助教授 (30177183)
• キーワード: DNA複製 / 染色体バンド構造 / レプリコン / DNAファイバー / 蛍光標識 / FISH

研究概要

生きている動物細胞に蛍光標識ヌクレオチドを取り込ませ、複製中のDNAをラベルすることで、実際に複製が起こっているDNA領域を視覚的に検出できる技術を確立した。これを用いて、染色体DNAが間期核内でどのような順序、空間的配置で複製されるのかを詳細に解析した。その結果、細抱周期のS期が進むにつれて複製部位が核の内部から外部へと徐々に移動し、それが分裂期染色体のR/Gバンド構造と密接に関連していることを明らかにした。このことから、染色体DNAが一見無秩序に詰め込まれているような間期核内でも、それらは高度に組織化され、DNA複製制御と密接に関わっていると推定した。
また、この方法で複製ラベルしたDNAを細胞核からファイバー状に引きのばし、より高解像度でDNA複製を解析できる技術を確立した。これにより、数千〜数十万塩基対の間隔でゲノム上に存在する複製開始領域を明確に検出することに成功した。これを用いて、細胞周期を同調した培養細胞でS期の最も初期に活性化される染色体複製ドメインを詳細に解析した結果、一つの複製ドメインを構成する複数のレプリコンのうち、最初に活性化されるレプリコンと、最初に活性化されたものに影響を受けて少し遅れて活性化されるレプリコンの二種類が存在することを明らかにした。また、細胞周期ごとに異なる標識を用いて複製ドメインを検出することで、複製ドメイン及び個々のレプリコンの利用(活性化)頻度を調べた結果、特定の複製ドメインはどの細胞周期でも安定に活性化される傾向にあったが、複製開始部位はそれほど厳密に決定されていないことを明らかにした。さらにFISH法と組み合わることにより特定のゲノム領域の解析ができるかを検討したところ、数十万塩基対にわたるマウスメジャーサテライト反復配列のみならず、1コピーしかないロドプシン遺伝子領域においても複製ドメインの構造を解析することに成功した。

研究成果

• [文献書誌] Takashi Shiina: "Genomic Anatomy of a Premier Major Histocompatibility Complex Paralogous Region on Chromosome 1q21-q22"Genome Research. 11巻5号. 789-802 (2001)
• [文献書誌] Atsushi Kohda: "Visualization of Biallelic Expression of the Imprinted SNRPN Gene Induced by Inhibitors of DNA Methylation and Histone Deacetylation"Bioscience,Biotechnology and Biochemistry. 65巻5号. 1236-1239 (2001)
• [文献書誌] Atsushi Kohda: "Preparation of Extended Metaphase Chromosomes from Human Cultured Cells Using a Topoisomerase II Inhibitor,ICRF-193"Bioscience,Biotechnology and Biochemistry. 65巻5号. 1248-1251 (2001)
• [文献書誌] Koji Yamawaki: "Identification of Human CPI-17,an Inhibitory Phosphoprotein for Myosin Phosphatase"Biochemical Biophysical Research Communications. 285巻4号. 1040-1045 (2001)
• [文献書誌] Shin-ichiro Takebayashi: "5-Aza-2'-deoxycytidine Induces Histone Hyperacetylation of Mouse Centromeric Heterochromatin by a Mechanism Independent of DNA Demethylation"Biochemical Biophysical Research Communications. 288巻4号. 921-926 (2001)
• [文献書誌] Mami Hata: "Characterization of a Processed Pseudogene of human ψHSP40 on Chromosome 2q32"DNA Sequence. 12巻4号. 293-297 (2001)
• [文献書誌] Shin-Ichiro Takebayashi: "Mapping Sites Where Replication Initiates in Mammalian Cells Using DNA Fibers"Experimental Cell Research. 271巻. 263-268 (2001)
• [文献書誌] Mitsuyoshi Nakao: "Regulation of Transcription and Chromatin by Methyl-CpG Binding Protein MBD"Brain Development. 23巻補1号. S174-S176 (2001)
• [文献書誌] Kazuhiro Kagotani: "Visualization of Transcription-dependent Association of Imprinted Genes with the Nuclear Matrix"Experimental Cell Research. (印刷中).
• [文献書誌] Kazuhiro Kagotani: "Replication Timing Properties within the Mouse Distal Chromosome 7 Imprinting Cluster"Bioscience,Biotechnology and Biochemistry. (印刷中).
• [文献書誌] Morihiro Ito: "Up-regulated Expression of a Novel Gene in Activated Human Peripheral Blood Mononuclear Cells That is a Truncated Paralog of the Human System L Amino Acid Transporter 1"International Journal of Biochemistry and Cell Biology. (印刷中).