系統的ES細胞株樹立法の開発

2001 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 13878132
• 研究種目: 萌芽的研究
• 研究機関: 新潟大学
• 研究代表者: 崎村 建司 新潟大学, 脳研究所, 教授 (40162325)
• キーワード: ES細胞 / 内部細胞塊 / C57BL / 6 / キメラマウス / 生殖系列遺伝

研究概要

本研究の目的は、様々な系統のマウスからES細胞株を系統的に樹立する方法を開発し、今後の発生工学を利用した研究に供することである。このために、(1)C57BL/6系統のマウスから再現性良くES細胞株が樹立できる方法を検索し、(2)得られたES細胞株から効率良く生殖系列遺伝するキメラマウスを作成する方法の検討した。
まず、C57BL/6N系統およびC57BL/6J系統の胚盤胞内部細胞塊からES細胞を分離する方法を検討した。3.5日胚をM16培地とD-MEM培地で培養した結果、乳酸含量の少ないD-MEM培地の方が内部細胞塊の分化速度が遅い傾向が認められた。また、培養された内部細胞塊からES細胞を分離するためにループ状のガラスキャピラリをシリコナイズしたナイフを作製し、効率よく細胞塊を採取できるようにした。さらに、細胞塊を分散させるトリプシンの濃度と処理時間の検討をおこない、細胞生存率の高い完全分散条件を決定した。
一方、得られたES細胞株から生殖系列遺伝キメラが効率的にできる条件を検討するために、胚の発生ステージと注入ES細胞数の関係を調べた。その結果、C57BL/6J系統のES細胞では、胚盤胞にES細胞を注入するよりも、2.5日胚(8細胞期)に注入する方が効率が高かった。また、キメラ率の高い個体を作るために必要な注入するES細胞数は、細胞の株と生育状況により異なることが明らかになった。すなわち一度の実験で効率よくキメラ個体を得るためには、注入するES細胞数を変化させたキメラ胚を作製し、それらを混合してレシピエントマウスに移植することである。さらに、胚の培養条件とES細胞の培養条件を同一にすることが効率的なキメラ胚を作製する上で重要な条件であることが明らかになった。

研究成果

• [文献書誌] Yamazaki, M.: "Differential palmitoylation of two mouse glutamate receptor interacting protein 1 (GRIP1) formes with different N-terminal sequences"Neuroscience Letters. 304. 81-84 (2001)
• [文献書誌] Minami, T.: "Characterization of the glutamatergic system for Induction and maintenance of allodynia"Brain Research. 895. 178-185 (2001)
• [文献書誌] Kitayama, K.: "Purkinje Cell-Specific and Inducible Gene Recombination System"Biochemical and Biophysical research Communications. 281. 1134-1140 (2001)
• [文献書誌] Yamada, K.: "NMDA receptor subunits GluR ε 1, GluR ε3 and GluR ζ 1 are enriched at the mossy fibre-granule cell synapse In the adult mouse cerebellum"European Journal of Neuroscience. 13. 2025-2036 (2001)
• [文献書誌] Takeuchi, T.: "Roles of the glutamate receptor ε2 and δ2 subunits In the potentiation and prepulse Inhibition of the acoustic startle reflex"Europian journal of Neuroscience. 14. 153-160 (2001)
• [文献書誌] Ikeno, K.: "The Lurcher mutation reveals Ca2+ permeability and PKC modification of the GluR δ channels"Neuroscience Research. 41. 193-200 (2001)
• [文献書誌] Hashimoto, K.: "Roles of Glutamate Receptor δ2 Subunit (GluR δ2) and Metabotropic Glutamate Receptor Subtype 1 (mGluR1) In Climbing Fiber Synapse Elimination during Postnatal Cerebellar Development"The Journal of Neuroscience. 21(24). 9701-9712 (2001)