| 研究課題/領域番号 |
13878144
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| 研究種目 |
萌芽的研究
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| 研究機関 | 秋田大学 |
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研究代表者 |
大森 泰文 秋田大学, 医学部, 講師 (90323138)
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| 研究分担者 |
榎本 克彦 秋田大学, 医学部, 教授 (20151988)
西川 祐司 秋田大学, 医学部, 助教授 (90208166)
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| キーワード | ギャップ結合 / コネキシン26 / 酵母two-hybrid法 / 遺伝子クローニング / 細胞間コミュニケーション / 分子生物学 / 細胞生物学 / タンパク間相互作用 |
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| 研究概要 |
本年度は酵母のtwo-hybrid法を用いて、コネキシン26結合タンパクの候補となるクローンを単離し同定を行った。baitとして、コネキシン分子種間で変化に富む細胞内ループドメインを使用することとし、ヒトコネキシン26cDNAの対応する領域でスクリーニング用ベクターを作成した。cDNAライブラリーはコネキシン26を高発現し機能の場と考えられている肝由来のものを構築することとし、倫理基準を満たし商用に供されているヒト肝由来polyA RNAを購入して常法に従いながら作成した。スクリーニングは酵母のmating法を採用し、1シリーズ当り2段階のスクリーニングを計7シリーズ行って多数のクローンを単離した。これらの陽性クローンのうち、偽陽性のものやライブラリー作成時のartifactと考えられるものを除外し、現在12の陽性クローンを得ている。遺伝子のデータバンクを用いて解析したところ、これらの陽性クローンのいくつかは、細胞膜に局在するタンパクと細胞骨格とを連結する機能を有するMAGUK protein familyに属していることがわかった。そこで、このようなタンパクをコネキシン26結合タンパクの第一候補とみなし、両者の結合を生化学的方法で検定するため、タグ(CBD)を融合させたクローンでcellulose affinity法や免疫沈降法を用いながら詳細な解析を進めている。次年度はこれらのクローンとコネキシン26の細胞内動態および両者の相互作用を、共焦点レーザー顕微鏡を用いながら解析すると共に、このような複合体形成の生物学的意義を遺伝子導入実験などで明らかにしていきたい。
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