| 研究課題/領域番号 |
13J04532
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| 研究機関 | 京都大学 |
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研究代表者 |
村山 秀平 京都大学, 工学研究科, 特別研究員(DC2)
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| 研究期間 (年度) |
2013-04-26 – 2015-03-31
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| キーワード | ＳＯＤ１タンパク質 / ｉｎ－ｃｅｌｌ ＮＭＲ法 / 神経変性疾患 |
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| 研究実績の概要 |
ｉｎ－ｃｅｌｌ ＮＭＲ法による筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）関連タンパク質であるＳＯＤ１の細胞内における構造学的研究を行った。
本研究では、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、凝集体を形成することが報告されている全長ＳＯＤ１及びループを切断した変異体ＳＯＤ１（ＳＯＤ１ΔＩＶΔＶＩＩ）を実験に用いた。ｉｎ－ｃｅｌｌ ＮＭＲ法により、全長ＳＯＤ１ではＮＭＲスペクトルを取得できなかったが、変異体ＳＯＤ１に関して細胞内におけるＮＭＲスペクトルの取得に成功した。測定の結果、ｉｎ－ｃｅｌｌ ＮＭＲスペクトルと生理的な条件であるｐＨ ７．４での試験管内でのＮＭＲスペクトルが、異なっている領域が確認された。結果、これはヒスチジン残基のプロトネーションが原因であることを明らかにした。加えて、今回測定に用いているＮＭＲチューブ内でストレスを受けた細胞では、細胞内がｐＨ ６．２±０．２程度の酸性条件になっていることが明らかになった。また、測定時間中は、変異体ＳＯＤ１に関して細胞内環境下でも、安定な構造を維持し、凝集を起こさないことが示された。また、
本研究が、タンパク質のミスフォールディングや凝集が原因とされる疾患に関して、その原因タンパク質の細胞内における構造情報を取得し、疾患メカニズム解析に寄与する一つのストラテジーを提案した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
競合研究による論文が発表されたため、急遽追加実験を行った上でそれまでのNMR実験のデータ解析結果を取りまとめた論文を発表しなければ、今後共同研究者の協力が得られなくなるという問題が生じ本研究目的の達成が困難となることが判明した。そのため研究の取りまとめ作業とそれに伴う新たな実験を行ったことにより、計画が変更となったから。
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| 今後の研究の推進方策 |
膜透過性ペプチドを用いるタンパク質導入法では、測定に十分なタンパク質を細胞に導入できない場合がある。そのため、より多量のタンパク質を細胞内に導入する手法・条件の検討、またＮＭＲ測定条件下で細胞を長時間培養する測定系が、必要と考えられる。そこで、次年度では、細胞へのタンパク質導入法として、電気穿孔法（エレクトロポレーション法）の適用と条件検討を行い、より汎用性の高い手法として確立する予定である。
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