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2013 年度 実績報告書

耐熱性酵素の動的挙動と反応性にせまる高温高分解能結晶構造解析にむけて

研究課題

研究課題/領域番号 13J04626
研究機関大阪大学

研究代表者

福田 庸太  大阪大学, 大学院工学研究科, 特別研究員(PD)

キーワードX線結晶構造解析 / 金属タンパク質
研究概要

申請書の計画通り、耐熱性銅含有亜硝酸還元酵素(CuNIR)の結晶を用いて高温(320K)で回折データ収集をおこない、基質である亜硝酸との複合体の高分解能(1.5Å)での構造決定を行った。この高温構造では、亜硝酸イオンは活性中心の銅イオンに対して、低温(100K)で収集した回折データから決定できた構造で見られた単座配位ではなく、2座配位をしていた。この結果は低温構造と高温構造で基質の結合様式が明らかになった世界で初めての例であり、現在論文投稿準備を進めている。これまで、構造生物学の世界ではモデルタンパク質として、その安定性の高さ、結晶化の容易さなどから、耐熱性タンパク質が広く用いられてきたが、こういった耐熱性のタンパク質を、低温で得られたデータをもとに構造解析した場合、本来の生理的な条件下での構造とは異なる構造が見えてしまう可能性を示唆するものであるため、本結果の意義は非常に大きいと考えられる。また、動的挙動を室温で観測する別の手法として、X線自由電子レーザー(XFEL)を用いた無損傷構造解析もおこなうことにした。耐熱性CuNIRの構造を分解能1.3ÅでCuNIRの構造を決定できた。この分解能はこれまでXFELを用いて決定されたもののうち最高分解能である(これまでの最高分解能はリゾチウムの1.9Å)。金属タンパク質の構造解析が高分解能・無損傷でおこなえるという事実が構造生物学界に与えるインパクトは非常に大きいものであり、現在論文の投稿準備を進めている。

現在までの達成度 (区分)
現在までの達成度 (区分)

1: 当初の計画以上に進展している

理由

当初は高温高分解能結晶構造解析のための条件検討のみでかなり時間を要すると考えられたが幸いにも高温でデータ測定ができる条件を見つけられたため、研究は順調に進んだ。のみならず、当初予定していなかった新たな解析法であるXFELによる構造解析がおこなえ、これが動的挙動解析に有用であることが明らかになった。

今後の研究の推進方策

本研究でモデルタンパク質として扱っている好熱菌由来の銅含有亜硝酸還元酵素の基質結合部位は、基質が結合していない時に水が結合しているが、これがX線照射中に2原子酸素分子種に変換されてしまうのではないかという問題と、X線照射により活性中心の銅イオンが容易に還元されてしまうという2つの問題が明らかになった。そこで、高温高分解能構造解析を他のタンパク質にも応用する一方で、上記の問題を解決するため、XFELを用いた無損傷構造解析により動的挙動解析をおこなう手法にも取り組んでいくつもりである。

  • 研究成果

    (4件)

すべて 2014 2013

すべて 雑誌論文 (2件) (うち査読あり 2件) 学会発表 (2件)

  • [雑誌論文] Structural insights into the function of a thermostable copper-containing nitrite reductase2014

    • 著者名/発表者名
      Y Fukuda, et al.
    • 雑誌名

      The Journal of Biochemistry

      巻: 155 ページ: 123-135

    • DOI

      10.1093/jb/mvt107

    • 査読あり
  • [雑誌論文] Structural and functional characterization of the Geobacillus copper nitrite reductase : roles of the unique N-terminal region on the interprotein electron transfer with its redox partner2014

    • 著者名/発表者名
      Y Fukuda, H Koteishi, et al.
    • 雑誌名

      Biochimica et Biephysica Acta Bioenergetics

      巻: 1837 ページ: 396-405

    • DOI

      10.1016/j.bbabio.2014.01.004

    • 査読あり
  • [学会発表] High temperature and high resolution X-ray crystallography of copper-containing nitrite reductase from thermophilic bacterium Geobacillus ther modenitrificans2013

    • 著者名/発表者名
      Yohta Fukuda
    • 学会等名
      International Conference on Structural Genomics2013
    • 発表場所
      札幌
    • 年月日
      2013-07-31
  • [学会発表] Atomic resolution structure of copper-containing nitrite reductase provides insights into the nature common to type 2 copper-containing enzymes2013

    • 著者名/発表者名
      Yohta Fukuda
    • 学会等名
      4th International Symposium on Diffraction Structural Biology
    • 発表場所
      名古屋
    • 年月日
      2013-05-27

URL: 

公開日: 2015-07-15  

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