| 研究課題/領域番号 |
13J04914
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| 研究機関 | 山梨大学 |
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研究代表者 |
太田 聡 山梨大学, 総合研究部, 特別研究員(PD)
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| 研究期間 (年度) |
2013-04-26 – 2016-03-31
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| キーワード | ゼブラフィッシュ / TALEN / ゲノム編集 / 左右非対称性 / ヘテロ二重鎖検出法 / 逆遺伝学 / 変異体 / Kupffer's vesicle |
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| 研究実績の概要 |
ヒトをはじめ多くの生物の体は外観こそ左右対称だが、体の内部では各種臓器が左右非対称に配置され機能している。本研究では左右非対称性に異常をきたすゼブラフィッシュ変異体を作製し、その表現型を解析することで脊椎動物の左右非対称性形成機構を明らかにすることを目指している。
1. 新規ゲノム改変技術であるTALENによりcapsla、rassf7b、rbp7a、zgc110373遺伝子を破壊したゼブラフィッシュをそれぞれ作製した。はじめに、これらの遺伝子に対するTALENを設計し、TALENコンストラクトの作製およびmRNAの合成を行った。合成したTALEN mRNAをゼブラフィッシュ胚へと微小注入し、成魚へと成長させた。成魚の中から次世代へと変異を残すF0ファウンダーを同定した。F0ファウンダーの子孫をさらに成長させ、その中から標的の遺伝子が破壊されたF1魚を同定した。各遺伝子について、変異をヘテロに持つ雄魚と雌魚を掛け合わせたが、その子孫に重篤な異常を示す個体は認められなかった。
2. TALENをゼブラフィッシュに最適化する過程で、ヘテロ二重鎖検出法がTALENのin vivo活性の評価に有用であることを見出した。TALEN mRNAの注入胚からゲノムDNAを抽出、標的遺伝子座をPCRにて増幅し、アクリルアミドゲルにて電気泳動すると、通常のホモ二重鎖に加えてその上方にラダー状にヘテロ二重鎖のバンドが出現することを明らかにした。このヘテロ二重鎖検出法はF0におけるTALENの活性評価に有用なだけでなく、F1以降の変異体の同定にも有用であることを明らかにした。ゲノム編集分野におけるヘテロ二重鎖検出法の有用性についてはGenes to Cells誌に報告した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
1. TALENは新規のゲノム編集技術であり、ゼブラフィッシュにおいては私たちのグループが国内で最初にTALENによる変異導入に成功した。
2. 私たちがTALENの開発に着手した当時、in vivoにおける有用な活性評価法はそれほど存在していなかった。私たちはヘテロ二重鎖検出法がシンプルながらゲノム編集分野において非常に有用であることを見出した。つい最近、CRISPR/Cas9システムというゲノム編集ツールも登場したが、ヘテロ二重鎖検出法はCRISPR/Cas9システムによる変異体の作製の際にもTALENの場合と同様に威力を発揮すると期待される。
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| 今後の研究の推進方策 |
1. capsla、rassf7b、rbp7a、zgc110373変異体は顕著な発生異常を示さなかったので、母性変異体を作製し、各遺伝子の機能が完全に欠損した場合の表現型を解析する。ゼブラフィッシュはcapsla遺伝子のパラログであるcapslb遺伝子を持っているので、capslaとcapslbの両遺伝子を破壊した変異体を作製する。
2. CRISPR/Cas9システムはTALENに取って代わる可能性を秘めた技術であるので、CRISPR/Cas9システムのゼブラフィッシュへの最適化についても着手する。
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